干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用。本发明专利技术首先提供了干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用。进一步提供了促进创面愈合的产品。本发明专利技术干细胞外泌体无免疫原性、无致瘤性，提取方法成熟、保存方便，将其贴附压疮皮肤，可降低创面组织中肌成胶原纤维含量、I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白和/或HMGB1和/或TGF‑β表达量，进而促进创面愈合。本发明专利技术使用外泌体替代因免疫原性、致瘤性原因导致临床使用严格的干细胞，消除干细胞治疗的局限性，且能达到相应治疗效果。

Application of stem cell exosomes in the preparation of wound healing promoting products

【技术实现步骤摘要】
干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用
本专利技术涉及医药
，具体涉及干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用。
技术介绍
干细胞疗法在再生医学和创面管理方面开辟了一个新的观点，尽管干细胞在再生医学和组织工程方面取得了重要进展，但在伤口愈合仍然是一个具有挑战性的临床问题，而且应用有一些局限性。外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)。应用间充质干细胞可以改善疾病，而旁分泌、免疫调节途径是其体内效应的主要机制，大量研究展示了外泌体作为干细胞治疗的治疗载体的潜力。外泌体可被细胞用作向其他细胞传递信号的信使和载体，改变它们在正常生理状态和疾病状态下的功能，而且可以从培养细胞中分离，一旦外泌体特性和生物学被更好地描述出来，治疗应用的潜力就会被更好地用于治疗疾病。外泌体是由高尔基体和内质网生成的内囊泡运输到细胞膜后释放出大小不等的小泡，电镜下可见外泌体直径在30到150nm之间，具有典型的杯状外观。干细胞外泌体含有膜蛋白(可以协助运输和靶向定位)的磷脂双层包裹。包含有Alix和TSG101；ERMS，Ezrin/Radisin/moesin蛋白；Flot1，Ftillin1；HSP，热休克蛋白；MHC，主要组织相容性复合体；RabGDI，RabGDP解离抑制剂；RAP1b，RAP相关蛋白1b等等，无细胞治疗在医学和伤口管理方面开辟了一个新的观点，尽管它有一些局限性，但通过外泌体来消除细胞治疗的局限性是有希望的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为如何避免干细胞在创面愈合治疗中的局限性。为解决上述技术问题，本专利技术提供了干细胞外泌体的应用。本专利技术干细胞外泌体的应用主要包括以下几点：干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用。干细胞外泌体在制备促进创面组织中肌成胶原纤维含量降低的产品中的应用。干细胞外泌体在制备促进创面组织中I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白表达量降低的产品中的应用。干细胞外泌体在制备促进创面组织中HMGB1和/或TGF-β表达量降低的产品中的应用。上述应用中，所述干细胞外泌体可来源于离体的脐带间充质干细胞。上述应用中，所述创面为表皮和/或真皮部分或全部缺失的创面，包括但不限于擦伤、割伤、烧伤(II-III度)、压疮等。在本专利技术具体的实施方式中，所述创面为压疮。本专利技术还提供了一种促进创面愈合的产品。本专利技术促进创面愈合的产品包含干细胞外泌体。活性成分为干细胞外泌体的促进创面愈合的产品也在本专利技术的保护范围之内。上述产品中，还包括医用海绵。上述产品中，产品的剂型为贴剂。上述产品的制备方法为将干细胞外泌体滴加到医用海绵中，用医用胶布贴附即得到所述产品。上文中，所述干细胞外泌体可来源于离体的脐带间充质干细胞。在本专利技术具体的实施方式中，所述干细胞外泌体是利用脐带间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞至P5-P10代后进行离心得到的上清过滤得到的。本专利技术干细胞外泌体利用WesternBlot检测标志性抗体CD9、CD63、CD81为阳性，在电镜下呈双凹圆饼形，NTA检测其粒径范围是110-130nm。上文中，所述产品可为制剂，如贴剂。本专利技术干细胞外泌体无免疫原性、无致瘤性，提取方法成熟、保存方便，将其贴附压疮皮肤，可降低创面组织中肌成胶原纤维含量、I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白和/或HMGB1和/或TGF-β表达量，进而促进创面愈合。本专利技术使用外泌体替代因免疫原性、致瘤性原因导致临床使用严格的干细胞，消除干细胞治疗的局限性，且能达到相应治疗效果。附图说明图1为脐带间充质干细胞流式细胞仪检测结果。图2为脐带间充质干细胞外泌体的WesternBlot结果。图3为脐带间充质干细胞外泌体的透射电镜观察结果。图4为脐带间充质干细胞外泌体的NTA检测结果。图5为实施例1中三组小鼠第1、3、7和14天的创面愈合情况。图6为实施例1中三组小鼠的创面收缩率比较结果。图7为实施例1中三组小鼠创面皮肤的HE染色结果和α-SMA免疫组化结果。图8为实施例1中三组小鼠创面组织的RT-qPCR检测结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1脐带间充质干细胞(huc-MSCs)外泌体在创面愈合上的应用一、脐带间充质干细胞(huc-MSCs)外泌体提取与鉴定1、脐带间充质干细胞的制备新生儿脐带由产科做剖腹产时提供(胎龄37-40周)，获得的脐带用生理盐水清洗，去脐带残留血液，分段剪成5cm，将每一段沿静脉腔剪开，平铺后剔除静脉，再深入剪开并剔除2根动脉，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物并剪切成1mm及以下小块，再以平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，置于37℃水浴箱中17h进行组织块消化，呈黏稠状时，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，使含胎牛血清在整个体系中的浓度达到20％，分装于培养瓶，置37℃、5％二氧化碳培养箱，得到第2代脐带间充质干细胞。取扩增传第2代脐带胶间充质干细胞，弃培养基，PBS轻洗2遍，用0.125％胰蛋白酶消化，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化后用磷酸盐缓冲液洗涤、重悬，调整细胞浓度为1×106个/mL单细胞悬液，取lmL/管，共6管，分别加入鼠抗人单克隆抗体CD73、CD105、CD166、CD45、CD34、CD14各20L，充分混匀，避光室温孵育30min，PBS洗2遍(250×g离心10rain)，重新制成细胞悬液0.5mL，流式细胞仪检测并鉴定HUMSC脐带血来源人MSC细胞人脐带血间充质干细胞。结果如图1所示，显示：脐带间充质干细胞表面标志的表达情况为CD73(99.3％)，CD105(95.9％)，CD166(97.2％)，CD45(0.34％)，CD34(0.06％)，CD14(0.6％)，即脐带间充质干细胞检测高表达脐带间充质干细胞抗原CD73、CD105、CD166而不表达造血干细胞抗原CD45、CD34和CD14。在适当的培养基中诱导后，为验证hucMSC脐带血来源，将人MSC细胞人脐带血间充质干细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞，从而鉴定间充质干细胞的成脂和成骨性。2、外泌体的制备鉴定后为脐带间充质干细胞的细胞贴壁后更换STEMCELL的脐带间充质干细胞培养基MesenCultTM-ACFPLUSMedium(Human)，在培养基中加辅助干细胞生长添加物(MesenCultTM-ACFPLUS500XSupplement)，以后每隔2～3d换液一次，细胞贴壁融合后传代培养，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱，以1∶3比例进行传代培养，每2～3d传代一次，培养至P4代后，以1∶2比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用。


2.干细胞外泌体在制备促进创面组织中肌成胶原纤维含量降低的产品中的应用。


3.干细胞外泌体在制备促进创面组织中I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白表达量降低的产品中的应用。


4.干细胞外泌体在制备促进创面组织中HMGB1和/或TGF-β表达量降低的产品中的应用。


5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：所述创面为压疮、擦伤、割伤或烧伤。

【专利技术属性】
技术研发人员：李富荣，于丽，闫飞，
申请(专利权)人：深圳市人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44