一种叶酸修饰载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体的制备制造技术

一种叶酸修饰载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体的制备，涉及叶酸修饰化胆固醇载降血压肽YGLF。将YGLF溶解在pH为4～9的缓冲溶液中作为水相；油相为二氯甲烷和甲醇混合相，将YGLF放入油相中超声，在冰浴下水相进入到油相中，得初乳状液；将乳化剂作为外水相溶液并与油相混合，搅拌超声后形成乳状液，再初乳状液混合，搅拌后得乳白色乳状液；将脂质膜材料磷脂、胆固醇和FA‑PEG化胆固醇混合后溶于有机溶剂氯仿中，减压，旋转蒸发挥去有机溶剂，得淡黄色的薄膜；将薄膜与乳白色乳状液混合，高温水化脱膜，超声后均质或挤出，得叶酸修饰载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体。

Preparation of core-shell nano liposome containing tetrapeptide yglf modified by folic acid

【技术实现步骤摘要】
一种叶酸修饰载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体的制备
本专利技术涉及叶酸修饰化胆固醇载降血压肽YGLF，尤其是涉及一种采用叶酸为靶头，包载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体的制备方法。
技术介绍
近年来，蛋白质和多肽陆续被发现具有药理活性，因此受到科学家的广泛关注，其中，不少肽的片段被证明具有降血压的活性。这些肽被从天然产物中发现，且也可通过重组DNA技术制备获得，较为安全，为高血压的治疗开辟了新视野。高血压给药临床多采用口服给药以增加患者顺应性。然而，这些可降血压的活性肽制成口服制剂时却面临着极容易被胃肠道酶类降解失活；渗透性差，无法顺利高效通过小肠内壁的黏液层；无法通过小肠上皮细胞间的紧密连接，被小肠上皮细胞特异性识别摄取；以及在血液循环中存在半衰期短等。因此，急需开发新型的降血压肽制剂，以解决上述问题，提高生物利用度。叶修修饰的核壳型纳米脂质体(纳脂体)，用于装载降压肽YF4(FA-YF4-LNPs)，可以克服胃肠道的恶劣环境且可以对其起到保护作用，叶酸配体也可特异性的被小肠上皮细胞上叶酸受体摄取，且其缓释功能则极大地保持了YF4的生理特性，提高其稳定性。有文献报道，利用叶酸修饰的纳米制剂装载胰岛素，可以增加胰岛素的口服生物利用度并增强其降血糖作用。在脂质体的表面修饰叶酸配体，制备叶酸修饰的纳脂体，能够提高小肠上皮细胞对纳脂体的摄取效率，并有效保护多肽免受胃肠道的降解，从而提高多肽的血药浓度和生物利用度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种叶酸修饰载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体的制备。本专利技术包括以下步骤：1)将YGLF溶解在pH为4～9的缓冲溶液中作为水相；油相为二氯甲烷和甲醇混合相，将YGLF放入油相中超声，在冰浴下水相进入到油相中，得初乳状液；2)将乳化剂作为外水相溶液，与步骤1)中的油相混合，搅拌超声后形成乳状液，再与步骤1)得到的初乳状液混合，搅拌后得乳白色乳状液；3)将脂质膜材料磷脂、胆固醇和FA-PEG化胆固醇混合后溶于有机溶剂氯仿中，减压，旋转蒸发挥去有机溶剂，得淡黄色的薄膜；4)将步骤3)中得到的薄膜与步骤2)中得到的乳白色乳状液混合，高温水化脱膜，超声后均质或挤出，得叶酸修饰载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体。在步骤1)中，所述超声的时间可为90s；所得的初乳状液可为水溶液。在步骤2)中，所述乳化剂可采用PVA乳化剂，所述乳化剂的含量按质量百分比可为1％；所述搅拌超声的时间可为40～50s；所制得的乳状液为W/O/W型乳状液，在乳状液中初乳体积与外水相的体积比可为1∶3。在步骤3)中，所述脂质膜材料可由胆固醇、大豆卵磷脂、FA-PEG化的胆固醇组成；所述胆固醇与大豆卵磷脂的质量比可为2∶1；FA-PEG化的胆固醇加入的比例可为胆固醇与大豆卵磷脂两者混合物的1％；所述减压的条件可在50rmp下旋转1h。在步骤4)中，所述水化脱膜的溶液可采用步骤2)中所得的溶液；所述乳白色乳状液与薄膜的质量比可为1.5∶1；所述均质或挤出的功率可采用100W。本专利技术采用脂质膜修饰的纳米粒子，解决了纳米颗粒细胞亲和性差和脂质体低稳定性的复杂问题。由于其优良的药物包封率，缓慢的释放行为，并可有效增强生物利用度，延长肽类的半衰期，以提高多肽的口服生物利用度。本专利技术以PLGA为内核和大豆卵磷脂，胆固醇和FA化胆固醇为壁材，采用薄膜水化法制备采用叶酸为靶头，包载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体，并对纳脂体的形态结构及稳定性，体外细胞摄取，体内降血压情况及SD大鼠体内药动实验，在体肠吸收动力学及安全性评价进行了分析。附图说明图1为本专利技术实施例的粒径图。图2为本专利技术实施例的Zeta电位图。图3为本专利技术实施例的丁达尔效应图。图4为本专利技术实施例的透射电镜图。图5为本专利技术实施例的稳定性图。图6为本专利技术实施例的体外释放图。图7为本专利技术实施例的差示量热扫描图。图8为本专利技术实施例在Caco-2细胞上的摄取图。数据以平均±SD(n＝3)表示。＊P＜0.05，*P＜0.01，**P＜0.001与LNPS/NPS。图9为本专利技术实施例在HT-29细胞上的摄取图。数据以平均±SD(n＝3)表示。＊P＜0.05，*P＜0.01，**P＜0.001与LNPS/NPS。图10为本专利技术实施例在SD大鼠上0～72h的药时曲线图。图11为本专利技术实施例在SD大鼠上0～12h的药时曲线图。图12为本专利技术实施例在SHR大鼠上的降压药效图。图13为本专利技术实施例在SD大鼠上的安全性评价。具体实施方式以下实施例将结合附图对本专利技术作进一步的说明。1、叶酸配体修饰的载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体的制备采用乳化溶剂挥发法制备YF4-NPs复乳：取适量体积的YF4溶液作为内水相(W1)、适量浓度的PLGA的二氯甲烷甲醇混合溶液作为油相(O)，将内水相快速加入至PLGA油相中，冰水浴下，细胞破碎仪探头超声，得到W1/O初乳；然后将W1/O初乳缓慢滴加入外水相溶液(W2)中，冰水浴下探头超声得到W1/O/W2复乳；37℃水浴条件下，减压旋蒸(75rpm)除尽有机溶剂，所得胶体溶液即为YF4-NPs。在YF4-NPs乳剂的基础上，采用薄膜水化-超声分散法对YF4-NPs进行脂质材料包衣，制得纳脂体(FA-FA-YF4-LNPs)。首先薄膜法制备磷脂膜，然后用上述最优工艺制备的YF4-NPs胶体溶液对磷脂膜进行水化，最后用超声进行破碎分散，得到YF4纳脂体(FA-YF4-LNPs)。具体操作如下：称取大豆卵磷脂，胆固醇(Chol)和FA化胆固醇适量于250mL茄形瓶中，加入氯仿使材料充分溶解，混匀，37℃减压旋蒸成膜(50rpm，1h)，缓慢除尽有机溶剂，制得一层均匀的薄膜；然后加入3ml已制备好的YF4-NPs，60℃水化(75rpm)0.5h。水化完成后的样品在冰水浴条件下超声，超声3s停3s。所得胶体溶液即为FA-YF4-LNPs。2.叶酸修饰YGLF纳脂体包埋率的测定2.1YGLF标准曲线的绘制用高效液相色谱法绘制YF4标准曲线，具体步骤如下：精密配制浓度为1mg/mL的YF4储备液。用此储备液分别取适量纯化水稀释，制得浓度为1、25、50、100、200、300、400、500μg/mL的系列标准溶液，过0.22μm滤膜后按照如下方法进行测定，记录峰面积。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，进行线性回归。YF4检测的HPLC色谱条件如下：色谱柱：(SymmetryC18色谱柱，250×4.6mm，4μm)；流动相：0.1％三氟乙酸水溶液：乙腈(70:30，v/v)；流速：1mL/min；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：20μL。2.2叶酸修饰YGLF纳脂体包埋率及载药量的测定采用超滤离心法(截留分子量为30000Da)操作分离未被包载的药物和纳脂体，测定FA-YF4-LNPs的包封率。下清本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种叶酸修饰载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体的制备，其特征在于包括以下步骤：/n1)将YGLF溶解在pH为4～9的缓冲溶液中作为水相；油相为二氯甲烷和甲醇混合相，将YGLF放入油相中超声，在冰浴下水相进入到油相中，得初乳状液；/n2)将乳化剂作为外水相溶液，与步骤1)中的油相混合，搅拌超声后形成乳状液，再与步骤1)得到的初乳状液混合，搅拌后得乳白色乳状液；/n3)将脂质膜材料磷脂、胆固醇和FA-PEG化胆固醇混合后溶于有机溶剂氯仿中，减压，旋转蒸发挥去有机溶剂，得淡黄色的薄膜；/n4)将步骤3)中得到的薄膜与步骤2)中得到的乳白色乳状液混合，高温水化脱膜，超声后均质或挤出，得叶酸修饰载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体。/n

【技术特征摘要】
1.一种叶酸修饰载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体的制备，其特征在于包括以下步骤：
1)将YGLF溶解在pH为4～9的缓冲溶液中作为水相；油相为二氯甲烷和甲醇混合相，将YGLF放入油相中超声，在冰浴下水相进入到油相中，得初乳状液；
2)将乳化剂作为外水相溶液，与步骤1)中的油相混合，搅拌超声后形成乳状液，再与步骤1)得到的初乳状液混合，搅拌后得乳白色乳状液；
3)将脂质膜材料磷脂、胆固醇和FA-PEG化胆固醇混合后溶于有机溶剂氯仿中，减压，旋转蒸发挥去有机溶剂，得淡黄色的薄膜；
4)将步骤3)中得到的薄膜与步骤2)中得到的乳白色乳状液混合，高温水化脱膜，超声后均质或挤出，得叶酸修饰载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体。


2.如权利要求1所述一种叶酸修饰载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体的制备，其特征在于在步骤1)中，所述超声的时间为90s；所得的初乳状液为水溶液。


3.如权利要求1所述一种叶酸修饰载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体的制备，其特征在于在步骤2)中，所述乳化剂采用PVA乳化剂，所述乳化剂的含量按质量百分比为1％。


4.如权利要求1所述一种叶酸修饰载四肽YGLF的核壳型纳米脂质体的制备，其特征在于在步骤2)中，所述搅拌超声的时间为4...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨剑，宋相容，赵胜楠，
申请(专利权)人：深圳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：广东;44