本发明专利技术公开了一种用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物，所述微卫星标记引物共有9个引物对，分别为PF‑3、PF‑4、PF‑11、PF‑13、PF‑16、PF‑27、PF‑30、PF‑44和PF‑48，还公开了一种合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法及上述微卫星标记引物在合浦珠母贝家系鉴定中的应用。采用本发明专利技术中的微卫星标记引物，首次在合浦珠母贝上利用荧光标记的多态微卫星标记建立了亲子鉴定平台，其鉴定准确率达到了90.24％；本发明专利技术方法能快速、有效地鉴别合浦珠母贝不同家系及来源，为合浦珠母贝的选育，繁殖配组和增殖放流评估提供了依据。
Microsatellite marker primers, identification methods and application for microsatellite family identification of Pinctada martensii in Hepu
【技术实现步骤摘要】
用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用
本专利技术属于贝类遗传育种的分子标记
，具体涉及一种用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用。
技术介绍
合浦珠母贝(Pinctadafucata)亦称"马氏珠母贝"，双壳纲，珍珠贝科，附着生活在水质澄清有珊瑚礁或多沙砾的浅海底，分布于南海，日本亦产，除产珍珠外，肉可食，壳可制纽扣，是中国及世界上海水珍珠培育的主要种类之一，我国华南沿海合浦珠母贝所产珍珠即为举世闻名的“南珠”。由于在长期的养殖过程中不注重选育种，并且养殖模式陈旧，养殖场地老化，育珠技术落后，致使养殖合浦珠母贝生长缓慢，珍珠质分泌能力下降，育珠能力降低，导致人工养殖珍珠质量和产量都明显下降，珠粒小，珠层薄，色泽差，珍珠养殖效益低下，许多养殖户放弃养殖珍珠而改养其它品种，严重限制了“南珠”养殖产业的发展。因此，尽快开展合浦珠母贝良种选育工作是促进其养殖业稳定、健康发展的必要手段。在贝类遗传育种研究中，清晰的系谱信息对于家系的选育和亲本的管理至关重要，同时也是明确个体间亲缘关系，建立正确系谱的重要手段。通过亲缘关系鉴定，开展家系分析研究可以阐明繁殖成功率，增殖放流幼体扩散等许多有关遗传学方面和繁殖生态学的科学问题。在合浦珠母贝育种过程中，亲本的数量都不会很多，加之逐代人工繁殖，导致了很多苗种出现了衰退现象。因此有效的系谱鉴定可以了解育种亲本的育种价值，同时对提高育种效率和生产实践都有重要意义。以微卫星分型为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。已应用到扇贝、太平洋牡蛎、耳鲍、凡纳滨对虾、中国对虾、牙鲆等水产经济动物育种中。目前，关于将微卫星标记应用于合浦珠母贝家系鉴定研究的报道甚少。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物。本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种利用上述微卫星标记引物进行合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法，该方法易于同时分型检测，可以用于合浦珠母贝的群体遗传结构，遗传育种学评估及亲子鉴定等，同时可大幅度节约实验成本。本专利技术所要解决的最后一个技术问题是提供一种利用上述用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物在合浦珠母贝家系鉴定中的应用。本专利技术所要解决的第一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物，所述微卫星标记引物共有9个引物对，分别为PF-3、PF-4、PF-11、PF-13、PF-16、PF-27、PF-30、PF-44和PF-48，其中：引物对PF-3的核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2中所示；引物对PF-4的核苷酸序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4中所示；引物对PF-11的核苷酸序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6中所示；引物对PF-13的核苷酸序列如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8中所示；引物对PF-16的核苷酸序列如SEQIDNO：9和SEQIDNO：10中所示；引物对PF-27的核苷酸序列如SEQIDNO：11和SEQIDNO：12中所示；引物对PF-30的核苷酸序列如SEQIDNO：13和SEQIDNO：14中所示；引物对PF-44的核苷酸序列如SEQIDNO：15和SEQIDNO：16中所示；引物对PF-48的核苷酸序列如SEQIDNO：17和SEQIDNO：18中所示。本专利技术所要解决的第二个技术问题是通过以下技术方案来实现的：上述合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法，包括以下步骤：(1)合浦珠母贝亲本及子代DNA提取：选取合浦珠母贝作为亲本进行全同胞家系繁殖，繁殖后选取亲本及子代肌肉组织，采用Magen动物DNA提取试剂盒提取，获得合浦珠母贝亲本及子代的DNA作为模板待用；(2)微卫星标记引物荧光修饰：选取权利要求1中的9个引物对，分成3组，其中PF-4、PF-11和PF-30为一组，PF-13、PF-27和PF-44为一组，PF-3、PF-16和PF-48为一组，在每组引物的正向引物5’端分别用FAM、HEX和ROX三种不同的荧光基团进行修饰，用于PCR分析；(3)荧光PCR：采用荧光PCR反应利用步骤(2)中荧光基团修饰过的9个引物对分别对步骤(1)中的亲本及子代的DNA进行PCR扩增，扩增产物按照步骤(2)中分组的方法进行混合，混合物作为上机待测样品；(4)合浦珠母贝微卫星家系鉴定：将上机待测样品采用基因分析仪进行分析，读取每个样品的基因型，对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，获得合浦珠母贝的微卫星家系。在上述合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法中：步骤(3)中荧光PCR反应时，20μL反应体系优选包括15.2μL双蒸水，2μL10×PCR缓冲液，浓度为10μm/L的正、反引物各0.6μL，浓度为10mm/L的dNTP0.3μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.3μL，1μLDNA模板。步骤(3)中荧光PCR反应时，优选95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，反应进行30个循环，最后72℃再延伸10min。步骤(4)中优选采用软件CERVUS3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本。采用软件CERVUS3.0可计算亲本和子代在各微卫星座位上等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率等信息，从而判定子代个体的父母本。进一步的，本专利技术提供的一种合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法，包括以下步骤：(1)合浦珠母贝DNA提取选取健康发育良好的合浦珠母贝作为亲本进行全同胞家系繁殖，剪取亲本及子代闭壳肌组织样品放于无水乙醇中，采用Magen软体动物DNA提取试剂盒来操作，检测质量和浓度后，稀释至100ng/μL，存放于-20℃保存备用；(2)多态性微卫星标记引物的筛选和引物合成选取9对微卫星引物，按照片段大小分成3组，其中，引物PF-4，PF-11，PF-30，为一组，引物PF-13，PF-27，PF-44，为一组，引物PF-3，PF-16，PF-48，为一组；在正向引物5’端分别用FAM，HEX，ROX三种不同的荧光基团进行修饰，用于PCR分析；(3)荧光PCR采用荧光PCR反应对亲本和子代DNA样品进行PCR扩增，扩增产物按照步骤(2)中所选微卫星引物分组的方法进行混合，作为上机检测的样品；(3)微卫星位点基因分型以及斑节合浦珠母贝微卫星家系鉴定样品在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500作为内参，用GeneMapperV3.2软件读取每个样品的基因型，采用CERVUS3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本。本专利技术所要本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物，其特征是：所述微卫星标记引物共有9个引物对，分别为PF-3、PF-4、PF-11、PF-13、PF-16、PF-27、PF-30、PF-44和PF-48，其中：/n引物对PF-3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中所示；/n引物对PF-4的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中所示；/n引物对PF-11的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中所示；/n引物对PF-13的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中所示；/n引物对PF-16的核苷酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中所示；/n引物对PF-27的核苷酸序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12中所示；/n引物对PF-30的核苷酸序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中所示；/n引物对PF-44的核苷酸序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16中所示；/n引物对PF-48的核苷酸序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18中所示。/n...
【技术特征摘要】
20160205 CN 20161008295741.一种用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物，其特征是：所述微卫星标记引物共有9个引物对，分别为PF-3、PF-4、PF-11、PF-13、PF-16、PF-27、PF-30、PF-44和PF-48，其中：
引物对PF-3的核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2中所示；
引物对PF-4的核苷酸序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4中所示；
引物对PF-11的核苷酸序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6中所示；
引物对PF-13的核苷酸序列如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8中所示；
引物对PF-16的核苷酸序列如SEQIDNO：9和SEQIDNO：10中所示；
引物对PF-27的核苷酸序列如SEQIDNO：11和SEQIDNO：12中所示；
引物对PF-30的核苷酸序列如SEQIDNO：13和SEQIDNO：14中所示；
引物对PF-44的核苷酸序列如SEQIDNO：15和SEQIDNO：16中所示；
引物对PF-48的核苷酸序列如SEQIDNO：17和SEQIDNO：18中所示。
2.一种合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法，其特征是包括以下步骤：
(1)合浦珠母贝亲本及子代DNA提取：选取合浦珠母贝作为亲本进行全同胞家系繁殖，繁殖后选取亲本及子代肌肉组织，采用Magen动物DNA提取试剂盒提取，获得合浦珠母贝亲本及子代的DNA作为模板待用；
(2)微卫星标记引物荧光修饰：选取权利要求1中的9个引物对，分成3组，其中PF-4、PF-...
【专利技术属性】
技术研发人员：张殿昌，朱克诚，江世贵，郭华阳，张楠，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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