一种快速定量检测霉菌毒素的检测卡及其应用制造技术

本发明专利技术实施例公开了一种快速定量检测霉菌毒素的检测卡及其应用，所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水垫，所述的结合垫中含有量子点标记的识别霉菌毒素的单克隆抗体，所述基膜上设置有检测线和控制线，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG的抗体；所述检测线上包被有霉菌毒素全抗原；本发明专利技术检测卡采用量子点标记识别霉菌毒素的单克隆抗体，通过采用量子点进行标记，能够大大提高荧光检测的灵敏度；此外，本发明专利技术检测卡可以快速、灵敏、定量的检测霉菌毒素，采用量子点定量读数仪能够快速、准确检测出结果，大大缩短了检测时间，为现场检测提供了方便。

A rapid and quantitative detection card for mycotoxin and its application

【技术实现步骤摘要】
一种快速定量检测霉菌毒素的检测卡及其应用
本专利技术实施例涉及霉菌毒素检测
，具体涉及一种快速定量检测霉菌毒素的检测卡及其应用。
技术介绍
黄曲霉素(AflatoxinAFT)，是一类真菌毒素，主要是由黄曲霉(Aspergillusflaw)、寄生曲霉(Aspergillusparasitwus)和集峰曲霉(Aspergillusnomius)产生的次生代谢产物。目前已分离鉴定出18种属于该类的毒素，黄曲霉毒素B1最常见，以下简称AFB1，它具有极强的致癌性，广泛存在于食品中，对其进行及时、快速、高效地检测和有效的分离，控制含量在允许的范围内至关重要。黄曲霉素是目前发现的化学致癌物中公认致癌性最强的物质之一，能使灵长类、禽类、鱼类及猴等实验动物诱发实验性肝癌，主要病变表现为肝出血、坏死、胆管增生和肝硬化等。玉米赤霉烯酮(Zearalenone简称ZEN)是广泛存在于饲料和谷物中的一种毒素，它是由真菌产生的次级代谢产物，对玉米、小麦、大麦、燕麦、稻谷等具有很强的污染性，它具有类雌激素作用，会对人和动物产生很大的危害。最近研究表明，ZEN除了对繁殖机能造成影响外，还具有免疫毒性、肝毒性和细胞毒性，且对肿瘤的发生也有一定影响。呕吐毒素(Deoxynivalenol简称DON)DON又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，是单端孢菌素烯烃中的一种。呕吐毒素属于剧毒或中等毒性的毒物，对人很动物都有很强的毒性，广泛存在于小麦等粮谷类农作物中，在世界范围内存在着较高的污染率，严重的威胁到人体的健康和安全。伏马毒素B1(Fumonisin简称FB1)是一种霉菌毒素，是由串珠镰刀菌(FusariummoniliformeSheld)产生的水溶性代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物。主要污染粮食及其制品，并对某些家畜产生急性毒性及潜在的致癌性，已成为继黄曲霉毒素之后的又一研究热点。赭曲霉毒素(Ochratoxina简称OTA)是由曲霉菌如赭曲毒、硫色曲委、蜂蜜曲霉以及绿青霉等产生的一类毒素。包括7种结构类似的化合物其中以赭曲霉毒素A(OTA)毒性最强，分布最广对人类和动物影响最大。OTA主要侵害动物的肾脏和肝脏，肾脏是第一靶器官只有剂量很大时才出现肝脏病变。大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死，还可在动物试验中观察到它的致畸作用。OTA作为一种天然污染物对食品污染的范围较广，主要包括谷类、咖啡和葡萄等及其相关产品。基于霉菌毒素的极大危害性，市场上对霉菌毒素的检测需求越来越大，建立快速、灵敏、准确的霉菌毒素检测技术具有重要意义。目前，霉菌毒素的检测方法有多种，目前检测霉菌毒素的主要分为两大类：即确认方法和快速方法。确认方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高压液相色谱法(HPLC)和各种联用技术如气质联用(GC-MS)、液质联用(HPLC-MS)等；快速方法主要是基于免疫化学基础上的免疫分析方法如免疫亲合柱-荧光检测(IAC-FLD)、酶联免疫吸附法(ELlSA)和胶体金免疫层析方法等。确认方法测定的结果准确，但是仪器设备价格昂贵，前处理过程复杂、操作繁琐、效率低，成本极高，因此不适用于大规模样本的筛查和日常的内控检测。快速方法酶联免疫吸附法ELISA法和胶体金快速检测卡是企业常用的快速检测方法，但也均存在各自的优缺点：ELISA方法能灵敏度相对较高，且能定量检测，但操作的过程相对复杂，步骤较多，检测时间较长，对环境和人员要求高，环境和基质干扰严重，且需要使用标准品，对操作人员危害比较大；胶体金检测卡可以满足现场快速的要求，能在5-10min内快速测定，但是只能定性，定量的范围很窄，且灵敏度较低，肉眼观察主观性较强，重复性差。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种快速定量检测霉菌毒素的检测卡，以解决现有技术中存在的操作复杂，步骤繁琐，检测时间较长，以及采用胶体金检测卡灵敏度较低、主观性较强、重复性差等问题。为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：根据本专利技术实施例的第一方面提供一种快速定量检测霉菌毒素的检测卡，所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水垫，所述的结合垫中含有量子点标记的识别霉菌毒素的单克隆抗体，所述基膜上设置有检测线和控制线，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG的抗体；所述检测线上包被有霉菌毒素全抗原。本专利技术检测卡采用量子点标记识别霉菌毒素的单克隆抗体，通过采用量子点进行标记，能够大大提高荧光检测的灵敏度；此外，本专利技术检测卡可以快速、灵敏、定量的检测霉菌毒素，采用量子点定量读数仪能够快速、准确检测出结果，大大缩短了检测时间，为现场检测提供了方便。进一步地，所述量子点为ZnS/CdSe复合量子点。本专利技术选择ZnS核/CdSe复合量子点微球，荧光强度高，量子点效率级数为0.5，稳定性好，且可以耐受多次激发；量子点的吸收光谱宽且连续，可实现一元激发，多元发射，适合于多色标记能够发射红光，且耐受时间长的效果，能够更好的提高检测卡的检测效果。进一步地，所述量子点标记的识别霉菌毒素的单克隆抗体通过如下方法制得：(a)将量子点进行清洗、活化；(b)将活化的量子点微球与识别霉菌毒素的单克隆抗体混匀、孵育；(c)将向孵育后的混合物中添加封闭液、再次孵育、离心、收集沉淀并重悬，即得所述量子点标记的识别霉菌毒素的单克隆抗体。进一步地，所述活化具体包括如下步骤：将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)分别溶解于pH6.050mMMES的缓冲液中，分别得到NHS溶液和DCC的溶液；随后，在清洗后的量子点中添加NHS溶液并混匀，再添加DCC溶液并混匀，然后室温孵育20-30min、离心去掉上清液、重悬即可。进一步地，所述NHS和DCC的溶液的浓度均为20mg/ml；所述NHS溶液、DCC溶液和量子点的体积比是1∶1∶2。进一步地，所述样品垫通过如下方法制得：将样品垫在含有1％TritonX-100、1％BSA、0.05％NaN3的pH7.40.01MPBS缓冲液中进行浸泡、烘干即可。进一步对，所述结合垫通过如下方法制得：将结合垫浸泡于含有0.2％TritonX-100、0.5％丙氨酸、0.05％NaN3的pH7.40.01MPBS缓冲液中，烘干；随后，将量子点标记的识别霉菌毒素的单克隆抗体喷涂到烘干后的结合垫上，干燥即可。进一步地，所述霉菌毒素为黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素、呕吐毒素或玉米赤霉烯酮。进一步地，所述霉菌毒素为黄曲霉毒素时，所述量子点标记的识别霉菌毒素的单克隆抗体中识别霉菌毒素的单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C201991的黄曲霉毒素总量AFT细胞株4E9株分泌得到，该黄曲霉毒素总量AFT细胞株4E9株，保藏编号为CCTCCNO:C201991，于2019年4月28日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学；所述霉菌毒素为赭曲霉毒素时，所述量子点标记的识别霉菌毒素的单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速定量检测霉菌毒素的检测卡，所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水垫，其特征在于，所述的结合垫中含有量子点标记的识别霉菌毒素的单克隆抗体，所述基膜上设置有检测线和控制线，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG的抗体；所述检测线上包被有霉菌毒素全抗原。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速定量检测霉菌毒素的检测卡，所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水垫，其特征在于，所述的结合垫中含有量子点标记的识别霉菌毒素的单克隆抗体，所述基膜上设置有检测线和控制线，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG的抗体；所述检测线上包被有霉菌毒素全抗原。


2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述量子点为ZnS/CdSe复合量子点。


3.根据权利要求1或2所述的检测卡，其特征在于，所述量子点标记的识别霉菌毒素的单克隆抗体通过如下方法制得：
(a)将量子点进行清洗、活化；
(b)将活化的量子点微球与识别霉菌毒素的单克隆抗体混匀、孵育；
(c)将向孵育后的混合物中添加封闭液、再次孵育、离心、收集沉淀并重悬，即得所述量子点标记的识别霉菌毒素的单克隆抗体。


4.根据权利要求3所述的检测卡，其特征在于，所述活化具体包括如下步骤：
将NHS和DCC分别溶解于pH6.050mMMES的缓冲液中，分别得到NHS溶液和DCC的溶液；随后，在清洗后的量子点中添加NHS溶液并混匀，再添加DCC溶液并混匀，然后室温孵育20-30min、离心去掉上清液、重悬即可。


5.根据权利要求4所述的检测卡，其特征在，所述NHS和DCC的溶液的浓度均为20mg/ml；所述NHS溶液、DCC溶液和量子点的体积比是1∶1∶2。


6.根据权利要求1或2所述的检测卡，其特征在于，所述样品垫通过如下方法制得：
将样品垫在含有1％TritonX-100、1％BSA、0.05％NaN3的pH7.40.01MPBS缓冲液中进行浸泡、烘干即可。


7.根据权利要求1或2所述的检测卡，其特征在于，所述结合垫通过如下方法制得：
将结合垫浸泡于含有0.2％TritonX-10...

【专利技术属性】
技术研发人员：武玉香，李建林，
申请(专利权)人：武玉香，
类型：发明
国别省市：山东;37