肌肉靶向的微环DNA基因治疗制造技术

本申请涉及肌肉靶向的微环DNA基因治疗。具体涉及一种用于在肌肉中长期高效表达治疗性基因产物的微环DNA载体。所述微环DNA载体配合肌肉靶向投递技术，可以在肌肉中长期高效表达治疗性基因产物，从而克服蛋白类药物半衰期有限、疗效无法持续的缺陷。所述微环DNA载体可以用于治疗常见的遗传性基因缺陷病或慢性疾病，具有安全、有效、低成本的优点。

【技术实现步骤摘要】
肌肉靶向的微环DNA基因治疗
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种微环(Minicircle，MC)DNA载体，更具体为一种肌肉靶向的微环DNA基因治疗。
技术介绍
蛋白类药物(包括激素、多肽)已广泛应用于多种单基因遗传病(MonogenicDisorders)及慢性病的临床治疗。但是蛋白/激素/多肽药物热稳定性不好，制备存储不便；而且其体内半衰期有限，需反复多次给药。特别是对于遗传性基因缺陷病和慢性病来说，往往需长期甚至终生给药，蛋白药物使用更是不便、费用难以承担。基因治疗可在体内持续表达目的基因产物，方便地实现长期治疗的目的。基因治疗的实质是将携带目的基因的基因载体投递至机体靶器官/组织，目的基因进入细胞后，利用宿主细胞的转录/翻译系统持续表达治疗性基因产物。肌肉(骨骼肌)接近体表，是由终末分化的肌肉细胞组成，转基因一但进入即可持续存在，是理想的基因治疗靶组织。基因载体及相应的基因投递手段是基因治疗的关键。基因载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体可主动进入宿主细胞，转染高效，是主流的基因载体，其中的代表是腺相关病毒(Adeno-associatedVirus，AAV)载体。相反，以质粒为代表的非病毒载体无法主动进入宿主细胞，体内转染有限。与本专利技术最类似的方案是基于AAV载体或基于质粒载体的基因治疗。AAV载体为代表的病毒载体其病毒外壳免疫原性强，容易引起剧烈的免疫反应，安全风险高。此外，基因随机整合导致的致癌和致畸风险也不容忽视。AAV载体基因容量有限，总包装容量是4.7kb，除去固有的ITR序列和启动子、polyA等调控序列，目的基因长度一般不能超过3.5kb。当目的基因较大时，AAV载体无法包装。而质粒载体的最大缺陷是体内转染效率低，表达难以持续。对于现有技术中存在的技术问题，微环(Minicircle，MC)DNA无免疫原性，无基因整合风险，不受目的基因大小限制，克服了质粒不能持续表达的缺陷，配合肌肉靶向投递技术，可以在肌肉中长期高效表达治疗性基因产物。
技术实现思路
本专利技术涉及微环(Minicircle，MC)DNA载体，以及肌肉靶向的微环DNA基因治疗。本专利技术提供了一种表达治疗性基因产物的重组基因载体，其中，所述重组基因载体包含所述基因产物的编码基因或目的基因。在一个方面中，所述基因产物选自蛋白质，多肽或核酸片段。优选的，所述蛋白质或多肽选自抗体、功能性蛋白、细胞因子、酶或激素，或者所述核酸片段选自基因片段，mRNA，siRNA，shRNA或miRNA。在一个方面中，所述重组基因载体选自非病毒载体或病毒载体。优选的，所述非病毒载体选自标准质粒或其它环状表达盒子，或者所述病毒载体选自逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体和腺相关病毒(Adeno-associatedVirus，AAV)载体。在一个方面中，所述功能性蛋白选自凝血因子IX(FIX)、凝血因子VIII(FVIII)或它们的变异体。优选的，FIX选自全长的、FIX-Padua突变体或FIX-KLW突变体。优选的，FVIII选自全长的、B区缺失型(B-domaindeleted)凝血因子VIII(BDD-FVIII)突变体或BDD-FVIII-FD突变体。所述非病毒载体选自微环DNA载体，或者所述病毒载体选自腺相关病毒载体。在一个方面中，所述FIX的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示，所述FIX-Padua的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，所述FIX-KLW的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示，所述BDD-FVIII的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示；所述BDD-FVIII-FD的氨基酸序列如SEQIDNO：8所示。在一个方面中，所述FIX具有与SEQIDNO：3所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列，且具有与之前FIX相同的功能；所述FIX-Padua具有与SEQIDNO：4所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列，且具有与之前FIX相同的功能；所述FIX-KLW具有与SEQIDNO：5所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列，且具有与之前FIX相同的功能；所述BDD-FVIII具有与SEQIDNO：7所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列，且具有与之前BDD-FVIII相同的功能；所述BDD-FVIII-FD具有与SEQIDNO：8所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列，且具有与之前BDD-FVIII相同的功能。在一个方面中，所述FIX编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，所述FIX-Padua编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示，所述FIX-KLW编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：11所示，所述BDD-FVIII编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示，所述BDD-FVIII-FD编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：13所示。在一个方面中，所述FIX编码基因具有与SEQIDNO：9所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列，且编码得到的FIX具有与之前FIX相同的功能；所述FIX-Padua编码基因具有与SEQIDNO：10所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列，且编码得到的FIX-Padua具有与之前FIX-Padua相同的功能；所述FIX-KLW编码基因具有与SEQIDNO：11所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列，且编码得到的FIX-KLW具有与之前FIX-KLW相同的功能；所述BDD-FVIII编码基因具有与SEQIDNO：12所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列，且编码得到的BDD-FVIII具有与之前BDD-FVIII相同的功能；所述BDD-FVIII-FD编码基因具有与SEQIDNO：13所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列，且编码得到的BDD-FVIII-FD具有与之前BDD-FVIII相同的功能。本申请还提供了一种之前所述重组基因载体的制备方法，具体步骤包括：(1)从现有技术中分别获取基因产物的编码基因或目的基因的序列；(2)根据上述(1)中的序列构建表达所述基因产物的重组基因载体；任选的，(3)在体内鉴定所述重组基因载体的表达水平，并检测基因产物对相关疾病的治疗效果；所述重组基因载体包含所述基因产物的编码基因或目的基因。在一个方面中，所述基因产物选自蛋白质，多肽或核酸片段。优选的，所述蛋白质或多肽选自抗体、功能性蛋白、细胞因子、酶或激素，或者所述核酸片段选自基因片段，mRNA，siRNA，shRNA或miRNA。在一个方面中，所述重组基因载体选自非病毒载体或病毒载体。优选的，所述非病毒载体选自标准质粒或其它环状表达盒子，或者所述病毒载体选自逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体和腺相关病毒载体。在一个方面中，所述功能性蛋白选自凝本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达治疗性基因产物的重组基因载体，其中，所述重组基因载体包含所述基因产物的编码基因或目的基因；/n优选的，所述基因产物选自蛋白质，多肽或核酸片段；更优选的，所述蛋白质或多肽选自抗体、功能性蛋白、细胞因子、酶或激素，或者所述核酸片段选自基因片段，mRNA，siRNA，shRNA或miRNA；/n优选的，所述重组基因载体选自非病毒载体或病毒载体；更优选的，所述非病毒载体选自标准质粒或其它环状表达盒子，或者所述病毒载体选自逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体和腺相关病毒载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达治疗性基因产物的重组基因载体，其中，所述重组基因载体包含所述基因产物的编码基因或目的基因；
优选的，所述基因产物选自蛋白质，多肽或核酸片段；更优选的，所述蛋白质或多肽选自抗体、功能性蛋白、细胞因子、酶或激素，或者所述核酸片段选自基因片段，mRNA，siRNA，shRNA或miRNA；
优选的，所述重组基因载体选自非病毒载体或病毒载体；更优选的，所述非病毒载体选自标准质粒或其它环状表达盒子，或者所述病毒载体选自逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体和腺相关病毒载体。


2.如权利要求1所述重组基因载体，其中，所述功能性蛋白选自凝血因子IX(FIX)、凝血因子VIII(FVIII)或它们的变异体；优选的，FIX选自全长的、FIX-Padua突变体或FIX-KLW突变体；优选的，FVIII选自全长的、BDD-FVIII突变体或BDD-FVIII-FD突变体；所述非病毒载体选自微环DNA载体，或者所述病毒载体选自腺相关病毒载体。


3.如权利要求1或2所述重组基因载体，其中，所述FIX的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示，所述FIX-Padua的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，所述FIX-KLW的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示，所述BDD-FVIII的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示；所述BDD-FVIII-FD的氨基酸序列如SEQIDNO：8所示。


4.如权利要求3所述重组基因载体，其中，所述FIX编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，所述FIX-Padua编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示，所述FIX-KLW编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：11所示，所述BDD-FVIII编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示，所述BDD-FVIII-FD编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：13所示。


5.如权利要求1-4中任一项所述重组基因载体的制备方法，具体步骤包括：
(1)从现有技术中分别获取基因产物的编码基因或目的基因的序列；
(2)根据上述(1)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：谌平，谢亦武，陈志英，
申请(专利权)人：深圳新诺微环生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44