特异性杀伤肿瘤细胞的病毒和肿瘤治疗药物制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性杀伤肿瘤细胞的病毒和肿瘤治疗药物，涉及生物技术领域。该病毒为重组溶瘤病毒，其基因组上具有外源启动子，该外源启动子位于病毒的必需基因的上游，以替代必需基因的天然启动子驱动必需基因在肿瘤细胞中表达且在正常细胞中不表达。该病毒可以特异性杀伤各种肿瘤细胞，且对肿瘤细胞具有较高的杀伤效率而对非肿瘤细胞安全。

Specific virus killing tumor cells and tumor therapeutic drugs

【技术实现步骤摘要】
特异性杀伤肿瘤细胞的病毒和肿瘤治疗药物
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种特异性杀伤肿瘤细胞的病毒和肿瘤治疗药物。
技术介绍
攻克癌症是世界难题。目前治疗癌症主要依靠传统的化疗放疗并结合近年发展的CART及抗体治疗。但各种治疗不是疗效差强人意就是副作用或潜在安全风险大。发展新奇安全高效的治疗方案势在必行。研究表明，发展溶瘤病毒治疗癌症具有广阔前景。溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，其能够在肿瘤细胞中复制，以杀伤肿瘤细胞，并且通过裂解的肿瘤细胞碎片引发癌症特异性的免疫反应强化杀灭原位癌细胞的能力或攻击已迁移的癌细胞。利用溶瘤病毒这一特性，将其用于治疗患者的肿瘤是一种具有广阔前景的治疗策略。溶瘤病毒通过遗传工程改造，使其选择性的在癌细胞中扩增并杀死癌细胞。目前多种溶瘤病毒靶向策略已被深入的研究。一个广泛使用的设计原则是删除病毒的编码拮抗正常细胞抗病毒通路的非必须基因，使其不能在正常细胞中复制，而细胞癌变使信号通路改变，溶瘤病毒在癌细胞中保持复制和杀伤活力。目前，已被很好建立起来的是WNT信号通路基因，如RAS，TP53，RB1，PTEN等；还与一些其它的肿瘤相关基因和信号通路，如哺乳动物细胞中的关键性病毒防御，是由干扰素和细胞因子介导，但癌细胞使这一通路失效，这就给病毒在癌细胞中复制繁殖提供了自由的空间。被FDA批准的第一个溶瘤病毒药物Imlygic(T-vec)，来源于1型单纯疱疹病毒(HSV-1)，其被改造删除了ICP34.5和ICP47两个基因，前者阻止正常细胞关闭蛋白合成机器以利于病毒繁殖，后者会抑制抗原递呈以逃避抗病毒的免疫反应。目前处于临床3期的Pexa-Vec，删除了胸腺甘酸激酶基因，使其只能在高激酶活性的细胞中复制，如肝癌。但目前，现有的溶瘤病毒对癌细胞的杀伤效果不强且广谱性极差。为了增加溶瘤病毒有效性和广谱性，保持病毒基因完整应该是更好的设计选择。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特异性杀伤肿瘤细胞的病毒和肿瘤治疗药物，其对肿瘤细胞具有较高的杀伤效率且对非肿瘤细胞安全，此外，该病毒基因组结构较完整，可杀伤多种类型的肿瘤细胞。本专利技术是这样实现的：第一方面，本专利技术提供了一种特异性杀伤肿瘤细胞的病毒，所述病毒为重组溶瘤病毒，其基因组上具有外源启动子，所述外源启动子位于所述病毒的必需基因的上游以驱动所述必需基因在肿瘤细胞中表达且在正常细胞中不表达。本专利技术提供的病毒为重组溶瘤病毒，在基因组上的必需基因上游引入外源启动子，该外源启动子替代必需基因的天然启动子，驱动表达下游必需基因在肿瘤细胞中表达，溶瘤病毒可正常复制，通过其复制特异性杀伤肿瘤细胞；当在正常细胞中时，该外源启动子不驱动必需基因表达，影响溶瘤病毒的复制，进而对正常细胞具有较好的安全性。另外，本专利技术提供的重组溶瘤病毒基因组中的原始基因没有被删除或破坏，因此，本专利技术提供的重组溶瘤病毒能够以较强的复制能力进行复制，以较高的杀伤率杀死肿瘤细胞，杀伤效果强且具有一定的广谱性，可杀伤多种类型的肿瘤细胞。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述外源启动子为肿瘤细胞特异性启动子；进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述肿瘤细胞特异性启动子选自端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)、人表皮生长因子受体-2启动子(HER-2)、E2F1启动子、骨钙蛋白启动子、癌胚抗原启动子、Survivin启动子和血浆铜蓝蛋白启动子中的任意一种。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述病毒的基因组上还具有增强子，所述增强子位于所述外源启动子与所述必需基因之间以增强所述必需基因的表达；进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述增强子为CMV或SV40增强子。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述病毒的基因组中的所述必需基因的类别为一种或多种，且每种所述必需基因的上游都分别具有所述外源启动子和所述增强子。也就说是，当所述必需基因的类别是多种时，其中的每种必需基因都由其各自的外源启动子和增强子构成的调控元件组进行调控。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，每种所述必需基因的拷贝数为一个或额外插入一个或多个，每个拷贝的所述必需基因的上游都具有所述启动子和所述增强子。也就是说，每种必需基因的拷贝数是多个，例如是2个时，那么这种必需基因在基因组序列上就有重复的两段序列，每段序列(即每个拷贝的基因)的上游具有上述外源启动子和增强子(如图1中A所示)。这样通过拷贝数的增加使该必需基因即使在癌细胞特异性启动子转录活性极低的癌细胞中也能充分表达支持病毒有效繁殖，进而增强溶瘤病毒杀灭肿瘤细胞的广谱性。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述病毒的基因组上还具有免疫刺激因子表达序列以及驱动该免疫刺激因子表达序列表达的病毒晚期基因启动子。其中，所述病毒晚期基因启动子受所述必需基因的表达产物调控。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述免疫刺激因子表达序列所表达的免疫刺激因子为白介素12(IL-12)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述病毒晚期基因启动子为HSV-1的糖蛋白D启动子(gD启动子)或腺病毒晚期基因E3启动子。该病毒晚期基因启动子受所述必需基因的表达产物调控，可以使得只有当必需基因表达时，病毒晚期基因启动子才会驱动下游的免疫刺激因子表达(如图1中B所示)。而该病毒只有在肿瘤细胞中才会表达所述必需基因，因此，当本专利技术的提供的病毒感染肿瘤细胞时，必需基因表达，进而调控病毒晚期基因启动子驱动下游的免疫刺激因子表达序列表达，表达的免疫刺激因子可以杀伤肿瘤细胞。该策略有利于增强其对肿瘤细胞的杀伤能力。而感染正常细胞的情况下，免疫刺激因子并不表达，进而不影响正常细胞的代谢，保证其对正常细胞的安全性。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述重组溶瘤病毒选自单纯疱疹病毒、柯萨奇病毒、流感病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒和腺病毒中的任意一种。需要说明的是，不同的溶瘤病毒可以选用不同的必需基因，例如：当所述重组溶瘤病毒为单纯疱疹病毒时，必需基因选自包膜糖蛋白L、尿嘧啶dna糖基化酶、衣壳蛋白、螺旋酶原酶亚基、DNA复制起始结合解旋酶、肉豆蔻酸衍生物蛋白、脱氧核糖核酸酶、外被丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、DNA包装末端酶亚基1、外被蛋白UL16、DNA包装蛋白UL17、衣壳三链亚基2、主要衣壳蛋白、包膜蛋白UL20、核蛋白UL24、DNA包装蛋白UL25、衣壳成熟蛋白酶、衣壳蛋白、包膜糖蛋白B、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶催化亚基、核出口层蛋白、DNA包装蛋白UL32、DNA包装蛋白UL33、核出口膜蛋白、大衣壳蛋白、衣壳三链亚基1、核糖核苷酸还原酶亚基1、核糖核苷酸还原酶亚基2、被膜宿主关闭蛋白、DNA聚合酶加工性亚基、膜蛋白UL45、外被蛋白VP13/14、反式激活蛋白VP16、外被蛋白VP22、包膜糖蛋白N、外被蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性杀伤肿瘤细胞的病毒，其特征在于，所述病毒为重组溶瘤病毒，其基因组上具有外源启动子，所述外源启动子位于所述病毒的必需基因的上游以驱动所述必需基因在肿瘤细胞中表达且在正常细胞中不表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性杀伤肿瘤细胞的病毒，其特征在于，所述病毒为重组溶瘤病毒，其基因组上具有外源启动子，所述外源启动子位于所述病毒的必需基因的上游以驱动所述必需基因在肿瘤细胞中表达且在正常细胞中不表达。


2.根据权利要求1所述的病毒，其特征在于，所述外源启动子为肿瘤细胞特异性启动子；
优选地，所述肿瘤细胞特异性启动子选自端粒酶逆转录酶启动子、人表皮生长因子受体-2启动子、E2F1启动子、骨钙蛋白启动子、癌胚抗原启动子、Survivin启动子和血浆铜蓝蛋白启动子中的任意一种。


3.根据权利要求1所述的特异性杀伤肿瘤细胞的病毒，其特征在于，所述病毒的基因组上还具有增强子，所述增强子位于所述外源启动子与所述必需基因之间以增强所述必需基因的表达；
优选地，所述增强子为CMV或SV40增强子。


4.根据权利要求3所述的特异性杀伤肿瘤细胞的病毒，其特征在于，所述病毒的基因组中的所述必需基因的类别为一种或多种，且每种所述必需基因的上游都分别具有所述外源启动子和所述增强子；
优选地，每种所述必需基因的拷贝数为一个或额外插入一个或多个，每个拷贝的所述必需基因的上游都具有所述外源启动子和所述增强子。


5.根据权利要求3所述的特异性杀伤肿瘤细胞的病毒，其特征在于，所述病毒的基因组上还具有免疫刺激因子表达序列以及驱动该免疫刺激因子表达序列表达的病毒晚期基因启动子；其中，所述病毒晚期基因启动子受所述必需基因的表达产物调控。


6.根据权利要求5所述的特异性杀伤肿瘤细胞的病毒，其特征在于，所述免疫刺激因子表达序列所表达的免疫刺激因子为白介素12或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。


7.根据权利要求1-6任一项所述的特异性杀伤肿瘤细胞的病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒选自单纯疱疹病毒、柯萨奇病毒、流感病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒和腺病毒中的任意一种；
优选的，当所述重组溶瘤病毒为单纯疱疹病毒时，必需基因选自包膜糖蛋白L、尿嘧啶dna糖基化酶、衣壳蛋白、螺旋酶原酶亚基、DNA复制起始结合解旋酶、肉豆蔻酸衍生物蛋白、脱氧核糖核酸酶、外被丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、DNA包装末端酶亚基1、外被蛋白UL16、DNA包装蛋白UL17、衣壳三链亚基2、主要衣壳蛋白、包膜蛋白UL20、核蛋白UL24、DNA包装蛋白UL25、衣壳成熟蛋白酶、衣壳蛋白、包膜糖蛋白B、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶催化亚基、核出口层蛋白、DNA包装蛋白UL32、DNA包装蛋白UL33、核出口膜蛋白、大衣壳蛋白、衣壳三链亚基1、核糖核苷酸还原酶亚基1、核糖核苷酸还原酶亚基2、被膜宿主关闭蛋白、DNA聚合酶加工性亚基、膜蛋白UL45、外被蛋白VP13/14、反式激活蛋白VP16、外被蛋白VP22、包膜糖蛋白N、外被蛋白UL51、解旋酶-引发酶引物酶亚基、包膜糖蛋白K、ICP27、核蛋白UL55、核蛋白UL56、转录调节因子ICP4、调节蛋白ICP22、包膜糖蛋白D和膜蛋白US8A中的一种或多种；
优选的，当所述重组溶瘤病毒为腺病毒时，必需基因选自早期蛋白1A、早期蛋白1B19K、早期蛋白1B55K、壳体化蛋白Iva2、DNA聚合酶、末端蛋白前体pTP、壳体化蛋白52K、衣壳蛋白前体pIIIa、五邻体基质、核心蛋白pVII、核心蛋白前体pX、核心蛋白前体pVI、六邻体、蛋白酶、单链DNA结合蛋白、六聚体组装蛋白100K、蛋白33K、壳体化蛋白22K、衣壳蛋白前体、蛋白U、纤维蛋白、调控蛋白E4开放阅读框6/7、调控蛋白E434K、调控蛋白E4开放阅读框4、调控蛋白E4开放阅读框3、调控蛋白E4开放阅读框2和调控蛋白E4开放阅读框1中的一种或多种；
优选的，当所述重组溶瘤病毒为牛痘病毒时，必需基因选自核苷酸还原酶小亚基、丝氨酸/苏氨酸激酶、DNA结合病毒核心蛋白、聚合酶大亚基、RNA聚合酶亚基、DNA聚合酶、巯基氧化酶、假定DNA结合病毒核蛋白、DNA结合磷蛋白、病毒核心半胱氨酸蛋白酶、RNA螺旋酶NPH-II、假定金属蛋白酶、转录延伸因子、谷胱甘肽类蛋白、RNA聚合酶、假定病毒核蛋白、晚期转录因子VLTF-1、DNA结合病毒核蛋白、病毒衣壳蛋白、聚合酶小亚基、依赖于DNA的RNA聚合酶亚单元rpo22、依赖于DNA的RNA聚合酶亚单元rpo147、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、IMV肝素结合表面蛋白、DNA依赖性RNA聚合酶、晚期转录因子VLTF-4、DNA拓扑异构酶Ⅰ型、mRNA盖酶大亚基、病毒核心蛋白107、病毒核心蛋白108、尿嘧啶-DNA糖基酶、三磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍泽堂，
申请(专利权)人：伍泽堂，
类型：发明
国别省市：安徽;34