一种分离培养脐带间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及细胞工程领域，特别涉及一种利用混合消化酶分离培养脐带间充质干细胞的方法，该方法采用以下步骤：(1)用含有中性蛋白酶II、胰蛋白酶和胶原蛋白酶的混合消化酶处理脐带组织；(2)培养消化后得到的脐带间充质干细胞；该方法通过含有中性蛋白酶II、胰蛋白酶和胶原蛋白酶的混合消化酶，大大缩短了消化时间，能够有效减少对脐带间充质干细胞的损伤，提高细胞得率。

【技术实现步骤摘要】
一种分离培养脐带间充质干细胞的方法
本专利技术涉及细胞工程领域，尤其涉及一种利用混合消化酶分离培养脐带间充质干细胞的方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是具有高度自我更新能力和多项分化潜能的多能干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪、羊膜液、胎盘、脐带血及脐带组织中。脐带间充质干细胞(CMSCs)是存在于新生儿脐带华通氏胶和血管周围组织中的一种间充质干细胞。来源于脐带的间充质干细胞取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、增殖能力强、免疫调节作用大，分泌细胞生长因子的总量也非常高，便于扩增和传代，同时又没有配型、排异等问题，因此具有广泛的应用前景。目前，常用于脐带间充质干细胞培养的方法包括贴壁法和酶消化法，其中贴壁法是将脐带剪成小块贴于培养皿表面，贴壁一周左右，待细胞爬出长满后消化传代。贴壁法制备脐带间充质干细胞的问题在于耗时长、成本高，通常需要一个月左右时间才能进行第一次传代操作，原代培养时间较长，耗费培养液和血清较多，这使得采用贴壁法生成脐带间充质干细胞的生成成本大大增加。此外，采用贴壁法培养脐带间充质干细胞的过程中容易出现组织贴壁不牢，容易脱落，细胞爬出较少，原代培养时间过长导致细胞老化，状态变差，使用效果变差等问题，贴壁法工程量巨大，例如一根脐带在P1代是细胞数量达10亿，贴壁不完全将大大增加操作难度，且爬出细胞分化程度和分裂不一，容易在后期造成细胞质地不均一，影响细胞的质量和使用。采用常规的酶消化法制备脐带间充质干细胞，虽然一次性获取细胞较多，但是采用胶原蛋白酶和胰蛋白酶结合消化脐带的华通氏胶组织细胞进行培养，胰蛋白酶是通过解离细胞间糖蛋白和黏蛋白来分离细胞的，消化过度容易对细胞造成损伤，损坏细胞膜，破坏细胞骨架影响细胞后续增殖和分化，导致细胞活性不佳，难以增殖到理想数目。在需要大量制备脐带间充质干细胞时，采用常规的酶消化法进行原代细胞的提取和制备，由于个体差异，消化酶对组织的消化速率很难把控，容易造成消化过度，细胞得率低，细胞壁被破坏，贴壁程度低，细胞状态差，严重影响后期扩增与诱导或基因改造工作。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种适合于大规模制备脐带间充质干细胞的方法，使用该制备方法能够缩短消化时间，减少细胞损伤，提高细胞得率。为实现以上专利技术目的，本专利技术提供一种分离培养脐带间充质干细胞方法，基于包含中性蛋白酶II、胰蛋白酶和胶原蛋白酶的混合消化酶，配合使用EDTA与DNA酶，大大缩短消化时间，从而有效减少细胞损伤，提高细胞得率。在本专利技术的一个方面，提供一种分离培养脐带间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：S1：用中性蛋白酶II消化离体的脐带组织；S2：加入胶原蛋白酶和胰蛋白酶对脐带组织进行消化处理；S3：加入含有EDTA和DNA水解酶的磷酸盐缓冲液进行消化处理；S4：分离脐带间充质干细胞，接种至培养基中进行培养。进一步的，本专利技术的方法还包括处理脐带的步骤：将脐带分割成长度约为0.5-2理由，优选为1厘米的组织块，并将组织块剪成糜状，浸泡在含有双抗，即青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液中形成组织悬液。进一步的，本专利技术方法的步骤S1中可采用0.05-0.50g/L，优选0.25g/L的中性蛋白酶II于37℃摇床15-60分钟，优选30分钟。进一步的，本专利技术方法的步骤S2中可加入胶原蛋白酶和胰蛋白酶后摇床1-10小时，在一个可选的实施方式中，于37℃摇床1-2小时，在另一个可选的实施方式中于4℃摇床6-10小时，优选8小时；其中胶原蛋白酶的工作液浓度为5-20mg/ml，优选10mg/ml，胰蛋白酶的工作液浓度为0.005-0.3％，优选0.125％。进一步的，本专利技术方法的步骤S2中可加入含有胶原蛋白酶和胰蛋白酶的溶液，以1：10的比例与组织悬液混合。进一步的，本专利技术方法的步骤S3中可按1：1的比例加入含有EDTA和DNA水解酶的磷酸盐缓冲液，之后于37℃摇床15-60分钟，优选30分钟，其中磷酸盐缓冲液中EDTA的浓度为0.01-0.05％，优选0.02％，DNA水解酶的浓度为0.01-0.1mg/ml，优选0.05％。进一步的，本专利技术的方法的步骤S4可为离心去除上清，将消化成的单细胞P0代接种至培养基中进行培养，可选的，将消化成的单细胞P0代接种于6个培养瓶中，每个培养瓶加入10ml含10％FBS的DMEM/F12培养液，静置培养一周后，至细胞融合度为80％。进一步的，本专利技术的方法还包括将分离培养得到的脐带间充质干细胞进行消化传代的步骤，可选的，所述消化传代包括使用胰蛋白酶和EDTA进行消化的步骤，可选的，胰蛋白酶和EDTA溶液中胰蛋白酶的工作浓度为0.05-0.5％，优选为0.25％；EDTA的工作浓度为0.01-0.05％，优选为0.02％。本专利技术的方法可用于分离培养人或哺乳动物的脐带间充质干细胞。本专利技术的方法分离培养的脐带间充质干细胞，其表达CD73、CD90、CD105，不表达CD45和HLA，符合间充质干细胞的特征。本专利技术的方法通过顺序使用中性蛋白酶II、胰蛋白酶和胶原蛋白酶，以及EDTA与DNA酶对脐带组织进行消化处理，大幅缩短了消化时间，与常规酶消化法相比，减少了对细胞的损伤。采用本专利技术的分离培养方法在一周内即可达到80％以上的细胞融合度，对比试验数据显示，通过本专利技术方法获得的脐带间充质干细胞，生长速度更快，细胞活性更强，可满足大规模生产的需求。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1所示为本专利技术方法、贴壁法和胰蛋白酶消化法提取的脐带间充质干细胞在生长一周后细胞状态图；其中图A为本专利技术方法的细胞生长情况图，图B为贴壁法的细胞生长情况图，图C为普通胰蛋白酶消化法的细胞生长情况图；图2所示为本专利技术方法、贴壁法和胰蛋白酶消化法提取的脐带间充质细胞P1代细胞生长速度图；图3所示为本专利技术方法、贴壁法和胰蛋白酶消化法提取的脐带间充质细胞P2代细胞在5％FBS条件下生长情况图；其中图D为本专利技术方法的细胞生长情况图，图E为贴壁法的细胞生长情况图，图F为普通胰蛋白酶消化法的细胞生长情况图；图4所示为本专利技术方法、贴壁法和胰蛋白酶消化法提取的脐带间充质细胞P2代细胞表型，其中4-1为贴壁法的P2代细胞的细胞表型检测结果；4-2为普通胰蛋白酶消化法的P2代细胞的细胞表型检测结果，4-3为本专利技术方法的P2代细胞的细胞表型检测结果。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术中。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离培养脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/nS1：用中性蛋白酶II消化离体的脐带组织；/nS2：加入胶原蛋白酶和胰蛋白酶对脐带组织进行消化处理；/nS3：加入含有EDTA和DNA水解酶的磷酸盐缓冲液进行消化处理；/nS4：分离脐带间充质干细胞，接种至培养基中进行培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离培养脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：用中性蛋白酶II消化离体的脐带组织；
S2：加入胶原蛋白酶和胰蛋白酶对脐带组织进行消化处理；
S3：加入含有EDTA和DNA水解酶的磷酸盐缓冲液进行消化处理；
S4：分离脐带间充质干细胞，接种至培养基中进行培养。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤S1为：加入0.05-0.50g/L的中性蛋白酶II摇床消化15-60分钟。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步骤S2中胶原蛋白酶的工作液浓度为5-20mg/ml，胰蛋白酶的工作液浓度为0.005-0.3％。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步骤S2中加入胶原蛋白酶和胰蛋白酶后于37℃摇床1-2小时，或于4℃摇床6-10小时。


5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步骤S3中磷酸盐缓冲液中EDTA的浓度为0.01-0.05％，DNA水解酶的浓度为0.01-0.1mg/ml。


6.如权利要求1所述的方法，其特征在于,所述方法步骤S3中加入含有EDTA和DNA水解...

【专利技术属性】
技术研发人员：高戎戎，佟艳辉，
申请(专利权)人：上海中溢精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31