一种靶向HER2联合表达PD1-MICA融合蛋白的嵌合抗原受体及其表达载体和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向HER2联合表达PD1‑MICA融合蛋白的嵌合抗原受体及其表达载体和应用，属于肿瘤免疫药物领域。所述嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向HER2的单链抗体、CD8α铰链区和跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽、PD1胞外区和MICA胞外区。该嵌合抗原受体在具备特异性靶向HER2阳性肿瘤细胞的同时分泌PD1‑MICA融合蛋白，靶向PD‑L1/PD‑L2阳性肿瘤细胞，封闭T细胞的PD1与PD‑L1/PD‑L2抑制信号，同时MICA胞外区能够结合NKG2D受体激活NK细胞，从而实现CAR‑T细胞在体内有效杀死HER2阳性肿瘤细胞的目的。

A chimeric antigen receptor targeting HER2 to co express pd1-mica fusion protein and its expression vector and Application

【技术实现步骤摘要】
一种靶向HER2联合表达PD1-MICA融合蛋白的嵌合抗原受体及其表达载体和应用
本专利技术涉及肿瘤免疫药物领域，特别涉及一种靶向HER2联合表达PD1-MICA融合蛋白的嵌合抗原受体及其表达载体和应用。
技术介绍
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，据不完全统计，目前中国的恶性肿瘤年发病病例达到400多万例。并且近年来的研究表明，肿瘤的发病率不断提高，发病年龄也有所提前，发病人群从过去的以中老年人居多，逐步扩散到年轻患者中，这可能与现代人生活压力大、环境污染加剧、生活习惯不健康等因素有关。乳腺癌是影响女性健康最常见的恶性肿瘤之一，HER2阳性乳腺癌患者占乳腺癌患者总数的15％～30％，该HER2阳性乳腺癌具有进展快、易转移、复发和预后差的特点。嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor，CAR)技术是近些年发展非常迅速的一种细胞治疗技术，用于治疗HER2阳性乳腺癌。目前，虽然在体外CAR-T细胞可以有效的杀死HER2阳性肿瘤细胞，但是在体内由于肿瘤微环境的影响，传统CAR-T细胞几乎无效。因此，亟需一种有效的嵌合抗原受体用于治疗HER2阳性乳腺癌。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本专利技术实施例提供了一种靶向HER2联合表达PD1-MICA融合蛋白的嵌合抗原受体及其表达载体和应用。所述技术方案如下：一方面，本专利技术实施例提供了一种靶向HER2联合表达PD1-MICA融合蛋白的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向HER2的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽、PD1胞外区和MICA胞外区，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，所述靶向HER2的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示，所述加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：4所示，所述胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：5所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：6所示，所述IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：7所示，所述PD1胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示，所述MICA胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：9所示。具体地，所述共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。优选地，所述共刺激因子为4-1BB，且所述共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：10所示。具体地，所述嵌合抗原受体还包括连接序列，所述连接序列连接在所述PD1胞外区和所述MICA胞外区之间。另一方面，本专利技术实施例提供了一种表达载体，所述表达载体包括载体和上述嵌合体抗原受体。具体地，所述载体为慢病毒载体。又一方面，本专利技术实施例提供了一种上述嵌合体抗原受体的应用，所述应用包括：将所述嵌合体抗原受体作为抗HER2阳性肿瘤药物。具体地，所述应用包括将所述嵌合体抗原受体作为抗HER2阳性乳腺癌药物。本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术实施例提供了一种靶向HER2联合表达PD1-MICA融合蛋白的嵌合抗原受体及其表达载体和应用，该嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向HER2的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽、PD1胞外区和MICA胞外区，该嵌合抗原受体在具备特异性靶向HER2阳性肿瘤细胞的同时分泌PD1-MICA融合蛋白，靶向PD-L1/PD-L2阳性肿瘤细胞，封闭T细胞的PD1与PD-L1/PD-L2抑制信号，同时MICA胞外区能够结合NKG2D受体激活NK细胞，从而实现CAR-T细胞在体内有效杀死HER2阳性肿瘤细胞的目的。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例一提供的靶向HER2的嵌合抗原受体的结构示意图；图2是本专利技术实施例二提供的慢病毒转染效率图；图3是本专利技术实施例二提供的细胞因子IFNγ分泌量的对比图，其中，CAR-T为转染CAR结构的CAR-T细胞，T为未转染的T细胞；图4是本专利技术实施例二提供的细胞因子IL-2分泌量的对比图，其中，CAR-T为转染CAR结构的CAR-T细胞，T为未转染的T细胞；图5是本专利技术实施例二提供的CART01与CART02的IL-2分泌对比图；图6是本专利技术实施例二提供的CART01与CART02的IFNγ分泌对比图；图7是本专利技术实施例二提供的CART01与CART02的TNFα分泌对比图；图8是本专利技术实施例二提供的CART01与CART02的IL-4分泌对比图；图9为本专利技术实施例二提供的细胞杀伤效率对比图，其中，A为本专利技术实施例提供的靶向HER2的嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞对SK-BR-3细胞的杀伤能力，B为未转染的T细胞对SK-BR-3细胞的杀伤能力，横坐标为效应细胞与靶细胞的个数比，纵坐标为细胞杀伤效率，单位为％。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。实施例一本专利技术实施例提供了一种靶向HER2联合表达PD1-MICA融合蛋白的嵌合抗原受体，如图1所示，该嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽(人CD8α信号肽，CD8αleader)、靶向HER2的单链抗体(HER2scFv)、加长的CD8α铰链区(人CD8α铰链区，CD8αHinge)、跨膜区(人CD8α跨膜区，CD8αtransmembrane)、共刺激因子、胞内信号肽(人CD3ζ胞内信号肽，CD3ζsignal)、P2A连接肽、IL2信号肽、PD1胞外区和MICA胞外区，信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，靶向HER2的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示，加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示，跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：4所示，胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：5所示，P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：6所示，IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：7所示，PD1胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示，MICA胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：9所示。具体地，共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。进一步地，共刺激因子为4-1BB(4-1BBsign本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向HER2联合表达PD1-MICA融合蛋白的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向HER2的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽、PD1胞外区和MICA胞外区，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述靶向HER2的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，所述IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述PD1胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示，所述MICA胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：9所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向HER2联合表达PD1-MICA融合蛋白的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向HER2的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子、胞内信号肽、P2A连接肽、IL2信号肽、PD1胞外区和MICA胞外区，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，所述靶向HER2的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示，所述加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：4所示，所述胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：5所示，所述P2A连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：6所示，所述IL2信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：7所示，所述PD1胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：8所示，所述MICA胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：9所示。


2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40...

【专利技术属性】
技术研发人员：张坤，
申请(专利权)人：华夏源上海细胞基因工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31