一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法，脱细胞材料包括胰酶、无菌1‑2M的氯化钠、Triton X‑100、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X‑200、乙醇、的叠氮化钠和液氮。本发明专利技术成功制造了一种双相复合材料，互补了腱膜细胞外基质的力学性能和肌肉细胞外基质的再生肌肉的生物学效应，可以更好地促进腱膜和肌肉组织的再生，使缺损再生的新生组织更符合原有腹壁生理结构，相对于不可降解补片，本材料体内可降解，较好地避免了材料长期残留带来的远期不良反应。

【技术实现步骤摘要】
一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法
本专利技术属于疝气修复及其再生
，具体涉及一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法。
技术介绍
腹壁疝是临床常见疾病，其可造成腹腔内容物的异常脱出，形成腹壁肿块，严重时可引起肠嵌顿，坏死。而目前常见的疝修补常采用人工聚乙烯等无生物活性材料，其不可降解，在长期体内植入中可引起慢性疼痛，炎症，感染，疝气复发等风险。作为一种以被动力学支持的惰性材料，人工合成补片通常引起纤维化来加强力学支持，而不能恢复正常的腹壁结构。腹壁由皮肤，皮下脂肪，腹壁肌肉，腱膜，肌筋膜，腹膜组成。腱膜和肌筋膜等腱性组织提供抗张力学支持，而肌肉可调节腹内压。因此，单纯纤维化不能完全恢复正常腹壁功能。而此前有文献报道，肌肉细胞外基质和肌腱细胞外基质可分别促进肌肉和肌腱修复。因此，本专利技术尝试用新工艺获取肌肉和腱膜细胞外基质复合体，来解决腹壁肌肉和腱膜无法再生的困难。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料及制备方法。a)为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：对天然组织来源的肌肉腱膜组织进行脱细胞处理。所述的天然组织来源的肌肉腱膜组织来源为哺乳动物腱膜肌肉组织；所述的脱细胞技术包括胰酶、NACL、TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、TritonX-200，叠氮化钠等化学试剂和物理冻融法组成的脱细胞方案，具体包括以下步骤：将初步物理去除腱膜周边脂肪组织；b)将腱膜肌肉复合体裁剪为5*5cm长宽，5-10mm厚度；c)将腱膜肌肉复合体放入液氮中10s，再拿出放入蒸馏水中，反复3次。d)将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为0.3％的叠氮化钠蒸馏水溶液中，以200转/秒的速度震荡1-2天；e)将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为75％的乙醇中，100转/秒的速度震荡1-2天；f)重复步骤d；g)将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1-2％的十二烷基硫酸钠中，以150转/秒的速度震荡1天；h)将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2-4％的TritonX-100中，以150转/秒的速度震荡1天；i)重复g,h步骤2-4次；j)将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为0.5％-1.5％的胰酶溶液中，37℃静置12-48小时；k)将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡12小时；l)将腱膜肌肉复合体放置于无菌1-2M的氯化钠中，以200转/秒的速度震荡1天；m)将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2-10％的脱氧胆酸钠中，以120转/秒的速度震荡1-3天；n)将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1-8％的TritonX-200溶液中，以150转/秒的速度震荡1天；o)将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡7天，每12小时换液；p)得到脱细胞双相腱膜肌肉。本专利技术的有益效果：本专利技术获取的腱膜肌肉复合体是一种良好的适合于腹壁疝修复的材料复合体。腹壁疝修复首先需要材料有足够的力学，以防止材料植入后由于骤变的腹内压而撕裂。传统的肌肉细胞外基质力学性能较差，虽然可以促进肌肉纤维的修复，但不足以承受较大的腹内压。作为一种复合材料，腱膜肌肉复合体材料较好模拟再现了体内肌肉作为收缩单位，腱膜作为力学传导分散单位的互补优点。腱膜细胞外基质力学性能相比同类可降解生物活性材料如肌肉细胞外基质和小肠粘膜下层更加强韧，可以有效桥接大范围肌肉缺损，从而减少早期疝气再发的风险。其次，理想的疝气修复需要材料在降解后能重构出有层次的肌肉腱膜新生组织。研究证实，腱膜组织细胞外基质纤维相对于其他组织来源的细胞外基质排列更加整齐，更适合于腱性组织细胞再生。而肌肉细胞外基质相对腱膜细胞外基质则力学刚度更低，利于肌肉干细胞的增殖，分化和肌管再生。在体内修复实验中，本研究证实了腱膜肌肉复合体材料可以诱导出腱纤维样取向性排列的粗大胶原纤维以及纤维下方岛状分布的新生细小肌肉丛。相比现有疝气补片，本专利技术显著的进步在于：1)以哺乳动物的肌肉腱膜组织作为材料获取来源，来源较为广泛。2)成功制造了一种双相复合材料，互补了腱膜细胞外基质的力学性能和肌肉细胞外基质的再生肌肉的生物学效应。3)相对于现有补片的促进纤维化增强腹部强度，本材料可以更好地促进腱膜和肌肉组织的再生，使缺损再生的新生组织更符合原有腹壁生理结构。4)相对于不可降解补片，本材料体内可降解，较好地避免了材料长期残留带来的远期不良反应。附图说明图1天然组织来源的腱膜肌肉复合体大体图。图2天然组织来源的腱膜肌肉复合体的HE染色(A,B),DAPI(C,D),myhc(E,F)染色，证明本材料细胞已被去除。Masson三色(G，H)和阿尔新蓝(I,J)，胶原含量(L)和GAG含量(M)证明多数活性物质被保留。图3细胞外基质的扫描电镜观察，证明细胞外基质保留完好(A-D)。拉力测试(E-H)证明材料的力学性能较为优异。图4腱膜肌肉复合体材料复细胞化，说明材料的细胞相容性良好(A-F)。Qrt-PCR结果表明肌肉和腱膜细胞外基质的生物学性质不同，可以促进细胞向腱细胞和肌细胞双相分化，说明材料有良好的生物学效应(G-J)。图5腱膜肌肉复合体材料的体内再生修复测试，证明材料可以恢复良好的腱膜肌肉结构(A-C)。而单纯单相材料和人工材料则不能恢复这样的结构(D-O)。图6腱膜肌肉复合体材料相对于目前广泛使用的人工补片，具有防黏连(A-D)，促进组织结构再生(E-J)，促进腹壁力学恢复的作用(K,L)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的一种天然组织来源的腱膜肌肉复合体材料及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。实施例1天然组织来源的猪小腿三头肌腱膜肌肉复合体细胞外基质的制备1、用剪刀去除猪小腿三头肌腱膜附近的脂肪，并裁成5cm*5cm*5mm大小；如图1所示，2、将腱膜肌肉复合体放入液氮中10s，迅速拿出放入蒸馏水中，反复3次。3、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为0.3％的叠氮化钠蒸馏水溶液中，以200转/秒的速度震荡1天；4、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为75％乙醇中，100转/秒的速度震荡1天；5、重复步骤3；6、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为1％SDS中，以150转/秒的速度震荡1天；7、将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为2％TritonX-100中，以150转/秒的速度震荡1天；8、重复6,7步骤2次；9、将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为0.5％胰酶溶液中，37℃静置12小时；10、将腱膜肌肉复合体放置于无菌蒸馏水中，以200转/秒的速度震荡12小时；11、将腱膜肌肉复合体放置于无菌1M的氯化钠中，以200本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料，其特征在于：/n包括质量分数为0.5％-1.5％的胰酶、无菌1-2M的氯化钠、质量分数为2-4％的TritonX-100、质量分数为1-2％的十二烷基硫酸钠、质量分数为2-10％的脱氧胆酸钠、质量分数为1-8％的Triton X-200、质量分数为75％乙醇、质量分数为0.3％的叠氮化钠和液氮。/n

【技术特征摘要】
1.一种天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的脱细胞材料，其特征在于：
包括质量分数为0.5％-1.5％的胰酶、无菌1-2M的氯化钠、质量分数为2-4％的TritonX-100、质量分数为1-2％的十二烷基硫酸钠、质量分数为2-10％的脱氧胆酸钠、质量分数为1-8％的TritonX-200、质量分数为75％乙醇、质量分数为0.3％的叠氮化钠和液氮。


2.根据权利要求1所述的天然组织来源的脱细胞双相腱膜肌肉的制备方法，其特征在于：
a)将初步物理去除腱膜周边脂肪组织；
b)将腱膜肌肉复合体裁剪为5*5cm长宽，5-10mm厚度；
c)将腱膜肌肉复合体放入液氮中10s，再拿出放入蒸馏水中，反复3次；
d)将腱膜肌肉复合体放置于质量分数为0.3％的叠氮化钠蒸馏水溶液中，以200转/秒的速度震荡1-2天；
e)将腱膜肌肉复合体浸入质量分数为75％的乙醇中，100转/秒的速度震荡1-2天；
f)重复步骤d...

【专利技术属性】
技术研发人员：林贤丰，王晟毓，王艺芸，范顺武，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属邵逸夫医院，浙江狄赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33