【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】嵌合多肽和改变它们的在细胞膜中的定位的方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年3月28日提交的美国临时专利申请系列号62/477,733和2017年11月16日提交的美国临时专利申请系列号62/587,262的优先权；其全部内容通过引用并入本文。
本公开涉及生物
，并且更具体地，涉及嵌合多肽的细胞定位的调节。专利技术背景嵌合抗原受体(CAR)是单链和多链多肽的亚类。嵌合抗原受体通常包括例如抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ或其他信号传导结构域。已经研究了将CAR用于哺乳动物中不同癌症例如血液学癌症的临床治疗中，并相当成功。然而，限制因素一直是与CAR抗癌活性相关的不可控制的毒性。核激素受体是一类包括几个结构域的多肽，其包括DNA结合基序和配体结合结构域。在配体不存在的情况下，天然存在的核激素受体与各种分子伴侣和其他相互作用蛋白缔合，将核激素受体隔离在细胞核之外。配体结合诱导核激素受体构象和相互作用配偶体的变化，并允许核激素靶基因的核易位和转录激活或抑制。虽然类固醇信号传导的经典观点认为这些激素结合充当配体激活的转录因子的细胞内受体，但据报道，类固醇也可以通过细胞表面处的非基因组机制起作用。专利技术概述本公开至少部分地基于以下发现：可以将包括跨膜结构域的嵌合多肽的可逆细胞外膜定位利用于医学应用中，其中期望在细胞外膜上可逆地表达感兴趣的蛋白质或肽。本公开的示例性特征是与CART细胞相关的毒性可以通过在其表面上可逆地表达CAR的抗原结合结构域来调节...
【技术保护点】
1.单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽包含：/n跨膜结构域；和/n激素受体配体结合结构域，/n其中：/n所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至500个氨基酸分隔；和/n所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170328 US 62/477,733;20171116 US 62/587,2621.单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽包含：
跨膜结构域；和
激素受体配体结合结构域，
其中：
所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至500个氨基酸分隔；和
所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。
2.权利要求1的单链嵌合多肽，其中所述跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。
3.权利要求1的单链嵌合多肽，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。
4.权利要求3的单链嵌合多肽，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。
5.权利要求1-4中任一项的单链嵌合多肽，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域彼此直接邻接。
6.权利要求1-4中任一项的单链嵌合多肽，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至500个氨基酸分隔。
7.权利要求6的单链嵌合多肽，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至250个氨基酸分隔。
8.权利要求7的单链嵌合多肽，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至50个氨基酸分隔。
9.核酸，其包含编码权利要求1-8中任一项的单链嵌合多肽的核苷酸序列。
10.载体，其包含权利要求9的核酸。
11.哺乳动物细胞，其包含权利要求10的载体。
12.诱导哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的膜定位的方法，所述方法包括：
使表达权利要求1-8中任一项的单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述单链嵌合多肽定位于所述细胞的质膜的细胞外侧。
13.可逆地改变哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的膜定位的方法，所述方法包括：
(a)使表达权利要求1-8中任一项的单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述单链嵌合多肽定位于所述细胞的质膜的细胞外侧；和
(b)使所述哺乳动物细胞与减少量的所述激素或所述激素类似物接触，所述减少量的激素或激素类似物导致所述哺乳动物细胞的质膜的细胞外侧的所述单链嵌合多肽的水平降低。
14.权利要求13的方法，其进一步包括：
(c)使所述哺乳动物细胞与增加量的所述激素或所述激素类似物接触，所述增加量的激素或激素类似物导致与步骤(b)中的水平相比，所述细胞的质膜的细胞外侧的所述单链嵌合多肽的水平增加。
15.权利要求12-14中任一项的方法，其进一步包括：
将编码所述单链嵌合多肽的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达所述单链嵌合多肽的哺乳动物细胞。
16.权利要求12-15中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。
17.权利要求16的方法，其中所述T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
18.权利要求12-17中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。
19.权利要求18的方法，其中所述受试者已鉴定或诊断为患有癌症。
20.权利要求18或19的方法，其进一步包括：
从所述受试者获得所述哺乳动物细胞。
21.权利要求12-20中任一项的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
22.权利要求12-20中任一项的方法，其中所述接触步骤在哺乳动物中进行。
23.单链嵌合抗原受体，其中所述单链嵌合抗原受体包含：
细胞外抗原结合结构域；
跨膜结构域；
激素受体配体结合结构域；
共刺激结构域；和
基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)；
其中：
所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至500个氨基酸分隔；和
所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。
24.权利要求23的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域选自下组：scFv、(scFv)2、VHH结构域和VNAR结构域。
25.权利要求24的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域是scFv。
26.权利要求23-25中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。
27.权利要求26的单链嵌合抗原受体，其中所述单一抗原是肿瘤抗原。
28.权利要求27的单链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。
29.权利要求28的单链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原是CD19。
30.权利要求23的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。
31.权利要求23-30中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。
32.权利要求23-31中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。
33.权利要求32的单链嵌合抗原受体，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。
34.权利要求23-33中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C和B7-H3。
35.权利要求34的单链嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域是4-1BB或CD28。
36.权利要求23-35中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述ITAM包含来自CD3ζ的细胞质信号传导序列。
37.权利要求23-36中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域彼此直接邻接。
38.权利要求23-36中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至500个氨基酸分隔。
39.权利要求38的单链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至250个氨基酸分隔。
40.权利要求39的单链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至50个氨基酸分隔。
41.核酸，其包含编码权利要求23-40中任一项的单链嵌合抗原受体的核苷酸序列。
42.载体，其包含权利要求41的核酸。
43.哺乳动物细胞，其包含权利要求42的载体。
44.诱导哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的膜定位的方法，所述方法包括：
使表达权利要求23-40中任一项的单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述单链嵌合抗原结合受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧。
45.改变哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的膜定位的方法，所述方法包括：
(a)使表达权利要求23-40中任一项的单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述单链嵌合抗原结合受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧；和
(b)使所述哺乳动物细胞与一定量的所述激素或所述激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致所述细胞的质膜的细胞外侧的所述单链嵌合抗原受体的水平降低。
46.权利要求45的方法，其进一步包括：
(c)使所述哺乳动物细胞与一定量的所述激素或所述激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致与(b)中的水平相比，所述细胞的质膜的细胞外侧的所述单链嵌合抗原受体的水平增加。
47.权利要求44-46中任一项的方法，其进一步包括：
将编码所述单链嵌合抗原受体的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达所述单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。
48.权利要求47的方法，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。
49.权利要求48的方法，其中所述T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
50.权利要求44-49中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。
51.权利要求50的方法，其中所述受试者已鉴定或诊断为患有癌症。
52.权利要求50或51的方法，其进一步包括：
从所述受试者获得所述哺乳动物细胞。
53.权利要求44-52中任一项的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
54.权利要求44-52中任一项的方法，其中所述接触步骤在哺乳动物中进行。
55.权利要求54的方法，其中所述哺乳动物患有癌症。
56.权利要求55的方法，其中所述接触步骤导致所述哺乳动物中所述癌症的治疗。
57.多链嵌合抗原受体，其中所述多链嵌合抗原受体包含至少一个第一多肽，所述第一多肽包含：
细胞外抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
激素受体配体结合结构域；
其中：
所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至500个氨基酸分隔；和
所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。
58.权利要求57的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域选自下组：scFv、(scFv)2、VHH结构域和VNAR结构域。
59.权利要求58的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域是scFv。
60.权利要求57-59中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。
61.权利要求60的多链嵌合抗原受体，其中所述单一抗原是肿瘤抗原。
62.权利要求61的多链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。
63.权利要求62的多链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原是CD19。
64.权利要求57的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。
65.权利要求57-64中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。
66.权利要求57-65中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。
67.权利要求66的多链嵌合抗原受体，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。
68.权利要求57-67中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域彼此直接邻接。
69.权利要求57-67中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至500个氨基酸分隔。
70.权利要求69的多链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至250个氨基酸分隔。
71.权利要求70的多链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至50个氨基酸分隔。
72.权利要求57-71中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述至少一个多肽进一步包含共刺激结构域。
73.权利要求72的多链嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C和B7-H3。
74.权利要求33的多链嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域是4-1BB或CD28。
75.诱导哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的膜定位的方法，所述方法包括：
使表达权利要求57-74中任一项的多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述多链嵌合抗原结合受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧。
76.改变哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的膜定位的方法，所述方法包括：
(a)使表达权利要求57-74中任一项的多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述多链嵌合抗原结合受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧；和
(b)使所述哺乳动物细胞与一定量的所述激素或所述激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致所述细胞的质膜的细胞外侧的所述多链嵌合抗原结合受体的水平降低。
77.权利要求76的方法，其进一步包括：
(c)使所述哺乳动物细胞与一定量的所述激素或所述激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致所述细胞的质膜的细胞外侧的所述多链嵌合抗原结合受体的水平增加。
78.权利要求75-77中任一项的方法，其进一步包括：
将编码所述单链嵌合抗原受体的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达所述单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。
79.权利要求78的方法，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。
80.权利要求79的方法，其中所述T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
81.权利要求75-80中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。
82.权利要求81的方法，其中所述受试者已鉴定或诊断为患有癌症。
83.权利要求81或82的方法，其进一步包括：
从所述受试者获得所述哺乳动物细胞。
84.权利要求75-83中任一项的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
85.权利要求75-83中任一项的方法，其中所述接触步骤在哺乳动物中进行。
86.权利要求85的方法，其中所述哺乳动物患有癌症。
87.权利要求86的方法，其中所述接触步骤导致所述哺乳动物中所述癌症的治疗。
88.治疗受试者中癌症的方法，其包括：
(a)向所述受试者施用表达权利要求23-40中任一项的单链嵌合抗原受体或权利要求57-74中任一项的多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞，其中所述抗原结合结构域与所述受试者中癌症表达的抗原特异性结合；
(b)向所述受试者施用一定量的激素或激素，所述激素或激素的量足以诱导所述单链或多链嵌合抗原受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧；
(c)确定(b)之后的所述受试者中与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性，与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者；
(d)将所述确定的与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性，所述确定的与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者与对照比较；和
(e)向所述受试者施用一定量的所述激素或激素类似物，所述激素或激素类似物的量足以降低所述细胞的质膜的细胞外侧的单链或多链嵌合抗原受体的水平，使得(e)之后的所述受试者中所述与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性，所述与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者降低。
89.权利要求88的方法，其中与步骤(b)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量减少至少25％。
90.权利要求89的方法，其中与步骤(b)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量减少至少50％。
91.权利要求90的方法，其中与步骤(b)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量减少至少75％。
92.权利要求91的方法，其中与步骤(b)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量减少100％。
93.权利要求88的方法，其中所述与毒性相关的一种或多种症状选自下组：高烧、肿胀、发冷、低血压、心动过速、无力、头痛、皮疹、喉咙发痒、呼吸困难、发红、极度疲乏、恶心和脑水肿。
94.权利要求88的方法，其中所述与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子选自下组：包括肿瘤坏死因子alpha、IFNγ、IL-10、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IL-10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-5。
95.单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽包含：
细胞外激素受体配体结合结构域；和
跨膜结构域，
其中：
所述激素受体配体结合结构域和所述细胞外跨膜结构域彼此直接邻接或者由1至700个氨基酸分隔；和
所述跨膜结构域和所述细胞外激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中单个内源性单链多肽中。
96.权利要求95的单链嵌合多肽，其中所述跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。
97.权利要求95的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。
98.权利要求97的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。
99.权利要求98的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域是来自人雌激素受体的配体结合结构域。
100.权利要求99的单链嵌合多肽，其中所述人雌激素受体的配体结合结构域具有野生型序列，除了其包含氨基酸位置521处的取代和氨基酸位置537处的取代之一或两者，每个相对于人激素受体的全长野生型序列进行编号。
101.权利要求95-100中任一项的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域彼此直接邻接。
102.权利要求95-100中任一项的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至700个氨基酸分隔。
103.权利要求102的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至500个氨基酸分隔。
104.权利要求103的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至250个氨基酸分隔。
105.权利要求104的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至100个氨基酸分隔。
106.权利要求105的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至50个氨基酸分隔。
107.权利要求106的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至25个氨基酸分隔。
108.权利要求95-100中任一项的单链嵌合多肽，其中，当以N末端至C末端方向移动时，所述单链嵌合多肽包含所述细胞外抗原结合结构域、所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域。
109.权利要求95-100中任一项的单链嵌合多肽，其中，当以C末端至N末端方向移动时，所述单链嵌合多肽包含所述细胞外抗原结合结构域、所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域。
110.权利要求95-100中任一项的单链嵌合多肽，其中，当以N末端至C末端方向移动时，所述单链嵌合多肽包含所述细胞外激素受体配体结合结构域、所述细胞外抗原结合结构域和所述跨膜结构域。
111.权利要求95-100中任一项的单链嵌合多肽，其中，当以C末端至N末端方向移动时，所述单链嵌合多肽包含所述细胞外激素受体配体结合结构域、所述细胞外抗原结合结构域和所述跨膜结构域。
112.核酸，其包含编码权利要求95-111中任一项的单链嵌合多肽的核苷酸序列。
113.载体，其包含权利要求112的核酸。
114.哺乳动物细胞，其包含权利要求113的载体。
115.权利要求114的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。
116.权利要求115的哺乳动物细胞，其中所述T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
117.诱导哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的质膜定位的方法，所述方法包括：
(a)使表达权利要求95-111中任一项的单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激...
【专利技术属性】
技术研发人员：S桑托罗，S科伊尔，L鲁普，P艾姆塔格，
申请(专利权)人：细胞设计实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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