一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用，属于免疫学检测领域。试剂盒含有酶标抗IgY抗体、磁标新城疫病毒抗原和发光底物液。先将磁标新城疫病毒抗原分别与稀释后的血清样本和标准品溶液混匀，形成磁标新城疫病毒抗原与新城疫病毒抗体复合物，然后进行磁分离，将沉淀物清洗后，将酶标抗体加入到沉淀物中，与复合物上的抗体结合，然后进行磁分离和沉淀物的清洗，再加入发光底物液，使发光底物与结合到复合物上的酶标抗体上的的酶反应，检测发光值，以加入标准品溶液的发光值绘制标准曲线，以加入待检测样品的发光值计算待测样品中抗体的含量。采用所述的试剂盒检测抗体，具有灵敏度和准确度高以及特异性强的效果。

A kit for detecting antibody of Newcastle disease virus and its application

【技术实现步骤摘要】
一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用
本专利技术属于免疫学检测领域，特别地，涉及一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用。
技术介绍
新城疫病毒(NDV)，有些地方称之为禽副粘病毒I型(APMV-1)，为副粘病毒科的腮腺炎病毒数。NDV的基因组是一条全程15156kb的单链负股RNA，分子量在5.2×106～5.6×106之间，可编码6种特异性结构蛋白。病毒颗粒具有双层包膜结构，该包膜由受感染机体细胞外膜的脂类与病毒的糖蛋白结合而衍生得到的。病毒颗粒内含一多盘绕的竹状衣壳，囊膜表面的糖蛋白具有血凝素和神经酰胺酶活性。新城疫俗称“鸡瘟”，新城疫病毒的强毒株引起多种禽类急性、高接触性、致死性传染病。由于其传播快、死亡率高，给禽养殖业带来毁灭性打击，造成非常严重的影响，国际兽疫局(OIE)将新城疫列为A类传染病，我国农业部也将其列为动物的一类疫病和优先防控的动物重大疫病之一。目前，我国大多数畜禽养殖场都进行了新城疫病毒疫苗的免疫接种，为了了解ND免疫状况，经常采用ND抗体水平来检测禽类的免疫效果。其中血清学诊断技术中最为流行的是血凝抑制实验，但该技术对操作人员的专业素质要求较高，过程繁琐，对结果的判定也有较强的的主观性，且对实验环境也有一定的要求，基本不能实现高通量的检测，而禽类养殖一般规模、养殖密度较大，需要检测的样本量也较大。因此，迫切需要开发一种操作简单、高灵敏度、高准确度、高通量的检测方法。
技术实现思路
本专利技术解决了现有技术中新城疫病毒抗体检测特异性不强、灵敏度和准确度不高的技术问题，提供了一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用。试剂盒中含有酶标二抗、磁标新城疫病毒抗原和发光底物液，磁标新城疫病毒抗原能与血清中的新城疫病毒抗体特异性结合，酶标二抗的抗体部分能与血清中的新城疫病毒抗体结合，酶标二抗的酶部分能与所述发光底物液中的发光底物发生反应，使所述发光底物发光。本专利技术提供的试剂盒应用于检测新城疫抗体时，具有较高的灵敏度、特异性和准确度的效果，而且实现了全自动化检测，缩短检测时间，提高检测通量，减少人为操作误差。按照本专利技术的第一方面，提供了一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，所述试剂盒含有酶标抗IgY抗体、磁标新城疫病毒抗原和发光底物液；所述磁标新城疫病毒抗原能与血清中的新城疫病毒抗体特异性结合；所述酶标抗IgY抗体的抗体部分能与血清中的新城疫病毒抗体结合，所述酶标抗IgY抗体的酶部分能与所述发光底物液中的发光底物发生反应，使所述发光底物发光；所述试剂盒用于定量检测禽类动物血清中的新城疫病毒抗体。优选地，所述酶标抗IgY抗体为碱性磷酸酶标抗IgY抗体，所述发光底物液中的发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷。优选地，所述酶标抗IgY抗体为辣根过氧化物酶标抗IgY抗体，所述发光底物液中的发光底物为3-氨基苯二甲酰肼。优选地，所述磁标新城疫病毒抗原为核壳结构；所述核壳结构的内核为超顺磁性纳米颗粒，所述核壳结构的外壳为新城疫病毒抗原和新城疫病毒抗原位点之外的封闭蛋白；所述超顺磁性纳米颗粒与所述新城疫病毒抗原和封闭蛋白通过共价结合和疏水作用连接。优选地，所述试剂盒中还含有标准品溶液、样本稀释液和浓缩洗涤液。优选地，所述碱性磷酸酶标抗IgY抗体通过以下方法制备得到，包括以下步骤：(1)将活化剂加入到碱性磷酸酶中，使所述碱性磷酸酶上引入马来酰亚胺基团，得到活化的碱性磷酸酶；(2)将还原剂加入到抗IgY抗体中，使所述抗IgY抗体中的二硫键断开，从而暴露出具有活性的巯基，得到具有活性巯基的抗IgY抗体，将该具有活性巯基的抗IgY抗体与步骤(1)得到的活化的碱性磷酸酶进行混合，在2℃-4℃条件下，使所述活化的碱性磷酸酶与所述具有活性巯基的抗IgY抗体发生偶联反应，再依次加入马来酰亚胺溶液和乙醇胺溶液，终止偶联反应，即得到碱性磷酸酶标抗IgY抗体；或者将N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯加入到抗IgY抗体中，使所述抗IgY抗体上引入惰性巯基，再加入羟胺溶液，使所述惰性巯基活化，得到具有活性巯基的抗IgY抗体，将该具有活性巯基的抗IgY抗体与步骤(1)得到的活化的碱性磷酸酶进行混合，在2℃-4℃条件下，使所述活化的碱性磷酸酶与所述具有活性巯基的抗IgY抗体发生偶联反应，即得到碱性磷酸酶标抗IgY抗体。优选地，所述活化剂为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯；所述还原剂为二硫苏糖醇；所述偶联反应的时间为16h-18h。优选地，所述抗IgY抗体为羊抗IgY抗体。按照本专利技术的另一方面，提供了任一所述的试剂盒应用于检测新城疫病毒抗体的方法，含有以下步骤：(1)将待测血清用样品稀释液对血清进行稀释；(2)取磁标新城疫病毒抗原分别与标准品溶液和稀释后的血清样本充分混匀，使所述标准品溶液和所述待测样品中的新城疫病毒抗体与所述磁标新城疫病毒抗原特异性结合，形成磁标新城疫病毒抗原与新城疫病毒抗体复合物，然后进行磁分离，弃上清液后将沉淀物用稀释后的浓缩洗涤液清洗；将碱性磷酸酶标抗IgY抗体或辣根过氧化物酶标抗IgY抗体加入到上述清洗后的沉淀物中，使碱性磷酸酶标抗IgY抗体或辣根过氧化物酶标抗IgY抗体与所述复合物上的抗体结合，然后进行磁分离，弃上清液后将沉淀物用稀释后的浓缩洗涤液清洗；(3)向步骤(2)得到的产物中加入发光底物液，使所述发光底物液中的发光底物与结合到所述复合物上的酶反应，检测发光值，以加入标准品溶液的浓度为纵横坐标，以发光值为纵坐标绘制标准曲线，以加入待检测样品的发光值计算待测样品中抗体的含量。优选地，步骤(3)所述标准曲线的建立包括以下步骤：(3-1)将血凝抑制效价分别为log2、2log2、3log2、4log2、5log2和6log2相对应的标准品的浓度分别定义为0.3AU/mL、0.6AU/mL、1.2AU/mL、2.4AU/mL、4.8AU/mL和9.6AU/mL；(3-2)将步骤(3-1)所述标准品浓度为横坐标，将所述标准品浓度对应的发光值为纵坐标，用四参数Logistic曲线拟合得到标准曲线。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：(1)本专利技术碱性磷酸酶标记抗体，采用活化剂对碱性磷酸酶进行活化从而引入酰胺基，采用衍生化试剂对抗IgY抗体处理，引入保护性巯基，再用羟胺处理使惰性巯基转化为具有反应活性的巯基，将活化后的碱性磷酸酶和活化的抗IgY抗体混合，通过酰胺基与巯基的结合制备出活性高、稳定性良好的碱性磷酸酶标抗体。或者将还原剂加入到抗IgY抗体中，使所述抗IgY抗体的二硫键断开，从而暴露出具有活性的巯基，得到具有活性巯基的抗IgY抗体。本专利技术提供了新的碱性磷酸酶标记抗体的技术应用在化学发光检测试剂盒中具有特异性强和准确度高的效果。(2)本专利技术新城疫病毒抗体的磁免疫化学发光检测试剂盒具有较高的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有酶标抗IgY抗体、磁标新城疫病毒抗原和发光底物液；/n所述磁标新城疫病毒抗原能与血清中的新城疫病毒抗体特异性结合；所述酶标抗IgY抗体的抗体部分能与血清中的新城疫病毒抗体结合，所述酶标抗IgY抗体的酶部分能与所述发光底物液中的发光底物发生反应，使所述发光底物发光；/n所述试剂盒用于定量检测禽类动物血清中的新城疫病毒抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有酶标抗IgY抗体、磁标新城疫病毒抗原和发光底物液；
所述磁标新城疫病毒抗原能与血清中的新城疫病毒抗体特异性结合；所述酶标抗IgY抗体的抗体部分能与血清中的新城疫病毒抗体结合，所述酶标抗IgY抗体的酶部分能与所述发光底物液中的发光底物发生反应，使所述发光底物发光；
所述试剂盒用于定量检测禽类动物血清中的新城疫病毒抗体。


2.如权利要求1所述的新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗IgY抗体为碱性磷酸酶标抗IgY抗体，所述发光底物液中的发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷。


3.如权利要求1所述的新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗IgY抗体为辣根过氧化物酶标抗IgY抗体，所述发光底物液中的发光底物为3-氨基苯二甲酰肼。


4.如权利要求1所述的新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述磁标新城疫病毒抗原为核壳结构；所述核壳结构的内核为超顺磁性纳米颗粒，所述核壳结构的外壳为新城疫病毒抗原和新城疫病毒抗原位点之外的封闭蛋白；所述超顺磁性纳米颗粒与所述新城疫病毒抗原和封闭蛋白通过共价结合和疏水作用连接。


5.如权利要求1所述的新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有标准品溶液、样本稀释液和浓缩洗涤液。


6.如权利要求2所述的新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标抗IgY抗体通过以下方法制备得到，包括以下步骤：
(1)将活化剂加入到碱性磷酸酶中，使所述碱性磷酸酶上引入马来酰亚胺基团，得到活化的碱性磷酸酶；
(2)将还原剂加入到抗IgY抗体中，使所述抗IgY抗体中的二硫键断开，从而暴露出具有活性的巯基，得到具有活性巯基的抗IgY抗体，将该具有活性巯基的抗IgY抗体与步骤(1)得到的活化的碱性磷酸酶进行混合，在2℃-4℃条件下，使所述活化的碱性磷酸酶与所述具有活性巯基的抗IgY抗体发生偶联反应，再依次加入马来酰亚胺溶液和乙醇胺溶液，终止偶联反应，即得到碱性磷酸酶标抗IgY抗体；
或者将N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯加入到抗IgY抗体中，使...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨海，计梦琴，杨宝凤，张德军，成诗琦，
申请(专利权)人：华中科技大学，武汉纳达康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42