一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及其应用技术

一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用。CoA与Cu(II)作用形成CoA‑Cu(II)配位聚合物，命名为CoA‑Cu(II)CP，其可以催化H

【技术实现步骤摘要】
一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及其应用
本专利技术涉及一种电化学生物传感器，尤其是涉及一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用，属于功能生物材料和生物传感

技术介绍
了解生物学中具有高度选择性和敏感性的分子或离子，如铜离子(Cu(II))、磷酸根离子(PPi)和碱性磷酸酶(ALP)，对于研究生命系统中发生的生理和病理过程至关重要。Cu(II)是人类和动物必需的微量元素，过量的Cu(II)会引起氧化应激并导致神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和威尔逊氏病。PPi是各种生化过程中的重要代谢产物。并且，许多研究表明，PPi可以用作某些疾病的指示剂，如关节炎和软骨钙化病。ALP，它是磷酸盐代谢中必不可少的水解酶，负责生物有机体中蛋白质，核酸或小分子的去磷酸化过程。此外，ALP异常水平可能与某些疾病有关，如动态骨疾病、肝功能障碍、糖尿病、乳腺癌和前列腺癌。由于它们的生物学重要性，因此开发简单、灵敏、可靠的测定Cu(II)、PPi和ALP的分析方法大有裨益。巯基-币族金属(如Au，Ag，Cu)配位聚合物已成为目前一类新兴的纳米材料，因其独特的发光性质、催化性质和圆二色性，引起越来越多研究者的关注，已广泛应用于很多科学领域，如催化和药物释放等。本专利技术基于铜的类核酸配位聚合物开发出一种快速、有效、无标记的Cu(II)、PPi离子传感器和ALP活性检测及其抑制剂筛选的电化学方法。选用辅酶A(CoA)作为底物，CoA可以与Cu(II)作用形成CoA-Cu(II)配位聚合物，命名为CoA-Cu(II)CP，其可以催化H2O2的分解。文献表明，Cu(II)与PPi有着很强的结合力。在PPi的存在下，PPi可以与Cu(II)形成Cu(II)-PPi复合物，致使CoA-Cu(II)CP无法形成。因此，H2O2的催化分解反应不能发生。通过ALP酶促分解反应，致使PPi分解和Cu(II)的释放，CoA-Cu(II)CP形成，H2O2的催化分解反应发生。与此同时，当我们加入ALP抑制剂，由于酶的活性被抑制导致底物PPi无法水解成Pi，阻碍了CoA-Cu(II)CP的形成，基于此，我们也实现了ALP抑制剂的筛选。目前，国内外还没有公开任何基于铜的类核酸配位聚合物构建的新型电化学方法用于检测Cu(II)、PPi、ALP及其抑制剂的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用。此方法首次将基于铜的类核酸配位聚合物构建的电化学生物传感器用于铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的检测。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用，具体步骤如下：(1)一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的电化学传感器的制备：Electrode1的制备：首先将玻碳电极(GCE，直径为1～4mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.01～0.1μm)抛光2～8min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2～8min，然后用N2吹干，得到裸玻碳电极，该电极记为Electrode1；Electrode2的制备：将石墨烯分散在HAc-NaAc(0.1～0.5M，pH4～7)缓冲溶液中，控制浓度为0.5～1.0mg·mL-1，超声分散1～2h。将裸GCE电极置于上述溶液中，通过循环伏安法在-1.5V～+0.5V的电位范围内以5～30mV·s-1的扫速扫描10～20圈。得到GO修饰电极，该电极记为Electrode2；Electrode3的制备：取Cu(II)(终浓度为0～500μM，0.5～1μL)和CoA(终浓度200～1000μM，0.5～1μL)加入到8～9μL磷酸缓冲溶液(10～100mM，pH5～8)中，在30℃恒温磁力搅拌机上震荡(100～600rpm)反应约8～10min，便得到CoA-Cu(II)CP。反应结束后，将此CoA-Cu(II)CP移至4℃冰箱避光保存备用。取2.5～5μL合成的CoA-Cu(II)CP溶液滴至Electrode2表面，10～30min后用PBS(10～100mM，pH5～8)冲洗电极，标记为Electrode3。(2)一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法的应用①Cu(II)的检测在Electrode3之CoA-Cu(II)CP合成过程中，固定CoA的浓度为1mM，改变Cu(II)的浓度，用于CoA-Cu(II)CP合成。其它如(1)步骤，制备一系列传感器，用来检测不同浓度Cu(II)的电化学响应。②PPi的检测在Electrode3之CoA-Cu(II)CP合成过程中，配位聚合物合成后，加入不同浓度的PPi，室温震荡5～10min。其它如(1)步骤，制备一系列传感器，用来检测不同浓度PPi的电化学响应。③ALP的检测在Electrode3之CoA-Cu(II)CP合成过程中，配位聚合物合成后，加入PPi(10～500μM，0.1～1μL)的溶液，室温震荡5～10min。反应完成后，在上述溶液中加入不同浓度的ALP溶液，混合溶液35～40℃孵育80～120min。其它如(1)步骤，制备一系列传感器，用来检测不同浓度ALP的电化学响应。利用上述一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法，检测Cu(II)、PPi浓度以及ALP活性。采用循环伏安法，设置电位范围为-1～0V，扫描速率为50mV·s-1，检测所制备电化学生物传感器在PBS(0.1M，pH7.0，含5mM的H2O2)中对Cu(II)、PPi、ALP的电化学循环伏安电流响应，获得Cu(II)、PPi、ALP对应的电化学循环伏安响应电流大小，建立响应电流与Cu(II)、PPi、ALP浓度对数之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中Cu(II)、PPi、ALP含量。专利技术原理：基于铜的类核酸配位聚合物开发出一种快速、有效、无标记的Cu(II)、PPi离子传感器和ALP活性检测及其抑制剂筛选的电化学方法。选用CoA作为底物，CoA可以与Cu(II)作用形成CoA-Cu(II)配位聚合物，命名为CoA-Cu(II)CP，其可以催化H2O2的分解。在PPi的存在下，PPi可以与Cu(II)形成Cu(II)-PPi复合物，致使CoA-Cu(II)CP无法形成。因此，H2O2的催化分解反应不能发生。通过ALP酶促分解反应，致使PPi分解和Cu(II)的释放，CoA-Cu(II)CP形成，H2O2的催化分解反应发生。与此同时，当我们加入ALP抑制剂，由于酶的活性被抑制导致底物PPi无法水解成Pi，阻碍了CoA-Cu(II)CP的形成，基于此，我们也实现了ALP抑制剂的筛选。相对于现有技术，本专利技术所述的一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用具有以下优势：(1)高灵敏度。实验得出传感器的电流响应对Cu(II)对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用，其特征在于，机理如下：CoA可以与Cu(II)作用形成CoA-Cu(II)配位聚合物，命名为CoA-Cu(II)CP，其可以催化H

【技术特征摘要】
1.一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用，其特征在于，机理如下：CoA可以与Cu(II)作用形成CoA-Cu(II)配位聚合物，命名为CoA-Cu(II)CP，其可以催化H2O2的分解。在PPi的存在下，PPi可以与Cu(II)形成Cu(II)-PPi复合物，致使CoA-Cu(II)CP无法形成。因此，H2O2的催化分解反应不能发生。通过ALP酶促分解反应，致使PPi分解和Cu(II)的释放，CoA-Cu(II)CP形成，H2O2的催化分解反应发生。与此同时，当我们加入ALP抑制剂，由于酶的活性被抑制导致底物PPi无法水解成Pi，阻碍了CoA-Cu(II)CP的形成，基于此，我们实现了铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的检测及其抑制剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡宇芳，胡丹丹，詹甜玉，郑宇迪，刘鑫达，冉平建，王邃，郭智勇，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33