一种改善猪体外原代黄体细胞功能的方法技术

本发明专利技术提供了一种改善猪体外原代黄体细胞功能的方法，所述方法通过在体外原代黄体细胞培养液中添加褪黑素，从而提高黄体分泌孕酮水平。本发明专利技术所述方法中添加浓度10

A method to improve the function of primary luteal cells in vitro

【技术实现步骤摘要】
一种改善猪体外原代黄体细胞功能的方法
本专利技术属于农业类畜牧兽医领域，具体地涉及一种通过在细胞培养液中添加褪黑素提高黄体分泌孕酮水平的方法。
技术介绍
母猪繁殖效率低是制约我国养猪业健康快速发展的关键因素之一，母猪繁殖性能直接影响猪场的经济效益。黄体(CL)是一种可以产生孕酮的内分泌腺，对调节发情和维持妊娠至关重要。黄体功能不足影响胚胎附植及妊娠维持，黄体分泌孕酮水平异常是导致母畜不孕或习惯性流产的主要原因。褪黑素是一种由松果体分泌的激素，目前研究表明褪黑素参与调节生物节律、睡眠和免疫细胞分化等，同时是一种重要的生殖激素。褪黑素在卵母细胞线粒体中合成，可以促进卵母细胞成熟，同时缓解热应激对猪卵母细胞及内质网损伤。褪黑素还能促进颗粒细胞黄体化，提高附植效率，维持妊娠。但褪黑素参与母猪卵巢黄体功能的调控机理尚不清楚。现有技术已公开了部分物种黄体中褪黑素相关合成酶和受体表达情况，褪黑素可以促进人黄体细胞孕酮合成，但抑制狒狒和马黄体细胞中孕酮的产生。褪黑素是否对猪原代黄体细胞孕酮分泌有影响未见报道。鉴于现有研究和技术中存在的问题，本专利技术将褪黑素应用到猪体外原代黄体细胞培养中，通过在培养液中添加的方式，最终提高黄体细胞分泌孕酮水平。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种通过在培养液中添加褪黑素来改善猪体外原代黄体细胞，促进孕酮合成分泌的方法。本方法的研究对象实例为猪体外原代黄体细胞，但本方法不仅适用猪，还适用于排卵后和妊娠过程中有黄体参与的其他家畜(牛、羊等)。为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：一种改善猪体外原代黄体细胞功能的方法，向细胞培养液中添加褪黑素，褪黑素的浓度为10-9M～10-5M；具体包括以下步骤：一、猪原代黄体细胞的分离1.将含有黄体的卵巢从屠宰场获得后置于冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并在2小时内运输到实验室；2.用PBS洗涤卵巢3-5次，然后将卵巢转移到细胞培养皿中，选择浅粉红色或黄色且黄体部分来自黄体周期早期和中期的黄体，用剪刀剪下镶嵌在卵巢上的黄体，并迅速置于PBS中；3.在超净工作台中，将取下的每个黄体沿着黄体中间剪开，去掉黄体被膜层，将黄体部分与黄体被膜层分开，黄体部分置于100mL小烧杯；4.在小烧杯中加入50mLPBS，轻轻吹打后，弃去液体；5.重复一次步骤4；6.将黄体部分转移至玻璃皿中，剪刀剪碎，机械分离黄体部分；7.将分离得到的黄体组织转移入15mL离心管，加入与黄体组织大致相同体积的0.1％胶原酶II，放在37.5℃、130rpm的水浴摇床中，震荡消化20min；8.消化结束后，用移液枪反复吹打50次左右，放在水浴锅中再震荡消化20min，消化后用移液枪反复吹打50次左右，1500r/min离心5min，在超净工作台中弃掉液体；9.再加入8-10mL的PBS，反复吹打重悬细胞，1500r/min离心5min，在超净工作台中弃掉液体；10.再加入8-10mL的红细胞裂解液，反复吹打重悬细胞，冰上静置8-10min，1500r/min离心5min，在超净工作台中弃掉液体；11.如果在下层沉淀中还看到有红色，重复步骤10；12.收集的细胞沉淀加入合适体积的DMEM/F12细胞培养液(LifeTechnologies，Invitrogen)，吹打重悬细胞，用70mm滤器(BDfalcon)过滤细胞重悬液，将收集的滤液1500r/min离心5min，在超净工作台中弃掉液体；二、将黄体细胞沉淀以3.5×105个细胞/ml的浓度重悬于有10％血清(FBS)的DMEM/F12培养基中，在培养基中添加褪黑素，褪黑素的浓度为10-9M～10-5M，然后接种到6孔板中，每孔培养液2mL，在37℃和5％CO2培养箱中培养；三、细胞培养24小时后，分别收集细胞培养液和黄体细胞，黄体细胞中加PBS重悬，5000r/min离心5min收集黄体细胞，加800微升trizol于-20℃，保存备用，细胞培养液测定孕酮含量，黄体细胞用于荧光定量检测孕酮合成相关基因表达检测。本专利技术的优点在于：(1)本专利技术在体外分离得到原代黄体后，在其培养液中添加褪黑素，并为进一步开展褪黑素提高母猪繁殖力的应用研究提供有益的参考。(2)本专利技术所述方法中添加物为褪黑素，天然无害，不会存在兽药残留、休药期等问题。(3)本专利技术所述方法中，使用10-8、10-7、和10-6M的褪黑素可以显著提高黄体分泌孕酮水平，效果明显。具体实施方式以下对本专利技术作进一步详细说明。以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。实施例1.猪黄体细胞的分离1.1.将含有黄体的卵巢从屠宰场获得后置于冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并在2小时内运输到实验室；1.2.用PBS洗涤卵巢3次，然后将卵巢转移到细胞培养皿中，选择浅粉红色或黄色且黄体部分来自黄体周期早期和中期的黄体，用剪刀剪下镶嵌在卵巢上的黄体，并迅速置于PBS中；1.3.在超净工作台中，将取下的每个黄体沿着黄体中间剪开，去掉黄体被膜层，将黄体部分与黄体被膜层分开，黄体部分置于100mL小烧杯；1.4.在小烧杯中加入50mLPBS，轻轻吹打后，弃去液体；1.5.重复一次步骤4；1.6.将黄体部分转移至玻璃皿中，剪刀剪碎，机械分离黄体部分；1.7.将分离得到的黄体组织转移入15mL离心管，加入与黄体组织大致相同体积的0.1％胶原酶II，放在37.5℃、130rpm的水浴摇床中，震荡消化20min；1.8.消化结束后，用移液枪反复吹打50次左右，放在水浴锅中再震荡消化20min，消化后用移液枪反复吹打50次左右，1500r/min离心5min，在超净工作台中弃掉液体；1.9.再加入8mL的PBS，反复吹打重悬细胞，1500r/min离心5min，在超净工作台中弃掉液体；1.10.再加入8mL的红细胞裂解液，反复吹打重悬细胞，冰上静置8min，1500r/min离心5min，在超净工作台中弃掉液体；1.11.如果在下层沉淀中还看到有红色，重复步骤10；1.12.收集的细胞沉淀加入合适体积的DMEM/F12细胞培养液(LifeTechnologies，Invitrogen)，吹打重悬细胞，用70mm滤器(BDfalcon)过滤细胞重悬液，将收集的滤液1500r/min离心5min，在超净工作台中弃掉液体。2.实验设计将黄体细胞沉淀以3.5×105个细胞/ml的浓度重悬于有10％血清(FBS)的DMEM/F12培养基(LifeTechnologies，Invitrogen)中。在培养基中添加不同浓度的褪黑素(10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M和0M)，在37℃和5％CO2培养箱中培养。3.样品收集与处理<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改善猪体外原代黄体细胞功能的方法，其特征在于，向细胞培养液中添加褪黑素，褪黑素的浓度为10

【技术特征摘要】
1.一种改善猪体外原代黄体细胞功能的方法，其特征在于，向细胞培养液中添加褪黑素，褪黑素的浓度为10-9M～10-5M。


2.如权利要求1所述的改善猪体外原代黄体细胞功能的方法，其特征在于，所述改善猪体外原代黄体细胞功能的方法，具体包括以下步骤：
一、猪原代黄体细胞的分离
(1)将含有黄体的卵巢从屠宰场获得后置于冰冷的PBS中并在2小时内运输到实验室；
(2)用PBS洗涤卵巢3-5次，然后将卵巢转移到细胞培养皿中，选择浅粉红色或黄色且黄体部分来自黄体周期早期和中期的黄体，用剪刀剪下镶嵌在卵巢上的黄体，并迅速置于PBS中；
(3)在超净工作台中，将取下的每个黄体沿着黄体中间剪开，去掉黄体被膜层，将黄体部分与黄体被膜层分开，黄体部分置于100mL小烧杯；
(4)在小烧杯中加入50mLPBS，轻轻吹打后，弃去液体；
(5)重复一次步骤(4)；
(6)将黄体部分转移至玻璃皿中，剪刀剪碎，机械分离黄体部分；
(7)将分离得到的黄体组织转移入15mL离心管，加入与黄体组织相同体积的0.1％胶原酶II，放在37.5℃、130rpm的水浴摇床中，震荡消化20min；
(8)消化结束后，用移液枪反复吹打50次，放在水浴锅中再震荡消...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国世，王静，张鲁，姬鹏云，李广栋，吕东颖，吴昊，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11