一种用于Saureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP制造技术

本发明专利技术属于抗菌剂技术领域，具体公开了一种用于S.aureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM‑AMP。AMP抗菌剂中的GKRWWKWWRR为抗菌肽，PLGVRG为明胶酶酶切序列，可被S.aureus菌分泌的明胶酶识别并切断，通过多肽固相合成法将二者偶联，形成具有明胶酶酶切位点的新型抗菌剂。再通过偶联剂将荧光素FAM标记到抗菌剂AMP上，标记后的FAM‑AMP可进一步通过毛细管电泳检测S.aureus菌的浓度。本发明专利技术制备的抗菌剂FAM‑AMP既可以检测S.aureus菌浓度又能有效灭菌，并且生物相容性好，对机体细胞的正常生理活动干扰小，毒性低，安全性高。

An antimicrobial agent fam-amp containing gelatinase digestion sequence for the detection of Saurus

【技术实现步骤摘要】
一种用于Saureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP
本专利技术属于抗菌剂
，具体公开了一种用于S.aureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP。
技术介绍
抗生素类药物在抗感染方面有着卓越的贡献，然而，抗生素类药物的广泛使用乃至滥用，导致了许多重要的人类病原菌已经表现出越来越强的耐药性，迫切需要找到不易产生耐药性的新型抗生素。抗菌肽(AMPs)有着传统抗生素无可比拟的优势，其抗菌机制独特，杀菌作用迅速且不易引发细菌的耐药性，是一类极具潜力的抗菌药物。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。但还存在毒性高、稳定性低和生产成本高等限制其开发成药物的问题需要解决。最近，已经开发了几种用于细菌检测的技术，例如荧光成像，表面增强拉曼光谱，免疫学和比色测定。然而例如比色测定，通常易受环境条件(即pH值，离子浓度和溶剂)的干扰，因此损害了细菌检测的特异性和准确性。
技术实现思路
为了解决现有技术中的不足，本专利技术将荧光素FAM与含有明胶酶酶切位点的AMP结合，提供了一种新型的抗菌剂FAM-AMP，本专利技术制备的抗菌剂不仅具有优异的抑菌性能，并且能够被S.aureus菌(金色葡萄球菌)分泌的明胶酶识别并切断，从而提出一种S.aureus菌检测新方法。通过荧光检测的毛细管电泳，将样品各组分根据其淌度和分配系数的差异进行高效快速分离，从而实现S.aureus菌的有效检测。与传统方法相比，本专利技术采用CE(毛细管电泳检测)具有分离效率高、灵敏度高、速度快、样品消耗低、成本廉价等优点。该抗菌肽自身并没有明显抗菌效果，但是在菌液中会被明胶酶切断，释放出抗菌肽序列，从而达到抗菌目的。可用于S.aureus菌检测，具有广泛的应用前景。本专利技术的具体技术方案如下所述：本专利技术制备的抗菌剂FAM-AMP由荧光剂以及含明胶酶酶切位点的抗菌肽组成。制备的抗菌剂FAM-AMP中荧光剂为5-FAM，其最大吸收波长为492nm，荧光发射波长为518nm。含明胶酶酶切位点的抗菌肽AMP的氨基酸序列为GKRWWKWWRRPLGVRGC，其中，GKRWWKWWRR为抗菌肽，PLGVRG为明胶酶酶切序列。AMP采用常规的Fmoc固相法合成，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸，直至合成所需肽链。荧光剂5-FAM标记AMP的方法为：称取相当于带有多肽的树脂3倍摩尔量的5-FAM、HOBT、EDC溶解于DMF中，加入DIEA避光过夜反应，最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来，经过HPLC进行纯化，并通过质谱进行分析。本专利技术制备的抗菌剂FAM-AMP可进一步通过荧光检测毛细管电泳(CE-FL)检测S.aureus菌浓度。荧光毛细管电泳检测S.aureus菌浓度的具体方法如下：CE-FL采用实验室自行搭建的检测系统。由高压电源(20kV)提供电场，内径75μm，有效长度50cm(外径365μm，总长75cm)的聚酰胺胶涂层毛细管连接正负极电泳槽，并固定在倒置荧光显微镜检测窗口，100W汞灯提供光源，并经过激发过滤器(BP420±20nm)和双色镜(DM455)处理，最终光纤光谱仪Maya-2000pro在检测窗口将光信号转为电信号在电脑终端形成电泳谱图。毛细管在使用前依次用1MHCl，1MNaOH和电泳缓冲液(25mMNa2B4O7，pH9.3)冲洗30min。电泳采用正极端手动进样。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术制备得到的FAM-AMP抗菌剂，自身并没有明显的抗菌效果，但是在S.aureus菌(金色葡萄球菌)菌液中会被明胶酶切断，释放出抗菌肽序列，从而达到抗菌目的。本专利技术制备得到的FAM-AMP抗菌剂能够被S.aureus菌分泌的明胶酶识别并切断，从而提出一种S.aureus菌检测新方法。通过荧光检测的毛细管电泳，将样品各组分根据其淌度和分配系数的差异进行高效快速分离，从而实现S.aureus菌的有效检测。本专利技术公开的制备工艺简单，原料来源广泛，反应条件温和，易于合成，适于推广使用。附图说明图1为AMP的HPLC图。图2为FAM-AMP的HPLC图。图3为FAM-AMP的质谱图。图4为AMP、FAM-AMP的紫外吸收图。图5为FAM-AMP的荧光发射图。图6(A、B)为S.aureus菌浓度对FAM-AMP酶切效果的影响图。图7为S.aureus菌浓度对FAM-AMP酶切效果的拟合曲线图。图8为FAM-AMP抗菌剂对S.aureus菌生长曲线的影响图。图9为不同浓度的FAM-AMP溶液中S.aureus菌的存活率。图10为E.coli菌浓度对FAM-AMP酶切效果的影响图。图11为FAM-AMP抗菌剂对E.coli菌生长曲线的影响图。图12为不同浓度的AMP溶液中S.aureus菌的存活率。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术进行详细阐述，但本专利技术不局限于这些实施例。实施例11、FAM-AMP的合成1)AMP的合成AMP是基于带有Fmoc保护基团的2-ChlorotritylChloride树脂，通过固相多肽合成法得到。具体为：分别称取相当于树脂5倍摩尔量的氨基酸(经化学修饰的α-氨基酸)、HBTU、HOBT，溶于DMF中，加入DIEA偶联30min。然后加入20％哌啶反应30min脱去Fmoc保护基，重复此步骤直达合成所需的肽链，合成后的肽链经HPLC纯化，纯化效果如附图1所示。2)5-FAM荧光素标记AMP称取30mg树脂(上述合成的有肽链的树脂)，和相当于树脂3倍摩尔量的5-FAM、HOBT、EDC溶解于1mLDMF中，加入10μLDIEA避光过夜反应，最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来，经HPLC纯化，分子量通过LC-MS确定，纯化图和质谱图如附图2和附图3所示。2、FAM-AMP抗菌剂的表征1)AMP、FAM-AMP抗菌剂紫外吸收的测定实验将合成的AMP、FAM-AMP经水系(0.22μm)滤膜过滤之后，稀释一倍，每个样平行测定三次，取平均值，用紫外分光光度计扫描AMP、FAM-AMP的紫外吸收，扫描的范围为300nm～800nm，紫外吸收图谱如附图4所示。由图可知，单独的AMP在300-800nm没有明显的吸收，而FAM-AMP在492nm有明显的吸收峰，说明了5-FAM成功标记上了AMP。2)FAM-AMP抗菌剂荧光发射的测定实验将合成的FAM-AMP抗菌剂经水系(0.22μm)滤膜过滤之后，稀释一倍，每个样品平行测定三次，取平均值，用荧光光谱仪测试FAM-AMP抗菌剂的荧光，荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP，其特征在于，所述的抗菌剂为荧光剂标记的含明胶酶酶切位点的抗菌肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP，其特征在于，所述的抗菌剂为荧光剂标记的含明胶酶酶切位点的抗菌肽。


2.根据权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于，所述荧光剂为5-FAM，其最大吸收为492nm，荧光发射为518nm。


3.根据权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于，所述含明胶酶酶切位点的抗菌肽AMP的氨基酸序列为GKRWWKWWRRPLGVRGC，其中，GKRWWKWWRR为抗菌肽，PLGVRG为明胶酶酶切序列。


4.根据权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于，所述AMP采用常规的Fmoc固相法合成，即固相树脂上被Fmoc保...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建浩，郭倩倩，贾文静，唐瑶，王菲，刘丽，邱琳，周舒文，崔朋飞，李玉亭，赵俊泽，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32