融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒、突变型感染性克隆及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒、感染性克隆及其制备方法和应用。融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，RGD短肽融合于PCV2 Cap蛋白上。本发明专利技术的融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒，是通过对PCV2 Cap蛋白进行了RGD多肽序列短肽修饰，RGD短肽融合于PCV2 Cap蛋白上，并在体外组装成表面融合RGD的PCV2病毒样颗粒。与野生型PCV2病毒样颗粒相比，融合RGD的PCV2病毒样颗粒免疫小鼠产生的PCV2特异性IgM和IgG抗体水平显著升高，能诱导产生高滴度的PCV2抗体，融合RGD的PCV2病毒样颗粒增强体液免疫应答。融合RGD的PCV2病毒样颗粒可应用于增强型VLPs和鉴别诊断的分子标签VLPs疫苗研制，为PCV2疫苗的研发提供了新思路。

Infective cloning of porcine circovirus type 2 virus like particles and mutations with RGD fusion and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒、突变型感染性克隆及其制备方法和应用
本专利技术涉及分子生物学与病毒学领域，特别地，涉及一种融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒和突变型感染性克隆。此外，本专利技术还涉及一种包括上述融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒和突变型感染性克隆的制备方法和应用。
技术介绍
猪圆环病毒(Porcinecircovirus，简称PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)，是一类无囊膜、正二十面体的单链环状DNA病毒，基因组大小约为1.7Kb。目前PCV有3个基因型，分别为猪圆环病毒1型(Porcinecircovirus1，简称PCV1)、猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus2，简称PCV2)及最新发现的猪圆环病毒3型(Porcinecircovirus3，简称PCV3)。据相关报道证实，PCV1不具有致病性，而PCV2则可产生许多相关疾病，而PCV3是否具有致病性仍在进一步探究中。PCV2是猪圆环病毒相关性系统疾病(PCV2-systemicdisease，PCV2-SD)的主要病原，在世界普遍流行，常与其他病原混合感染，造成巨大的经济损失。目前，基于PCV2Cap蛋白(Capsidprotein)组装的病毒样颗粒(Virus-likeparticles，VLPs)亚单位疫苗因具有高效和安全的特点，已经被广泛应用于猪场PCV2的预防。PCV2Cap蛋白是PCV2唯一的核衣壳蛋白，也是主要免疫原性蛋白，有7个不规则的Loops结构。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)能特异性识别细胞表面的整合素，研究表明，RGD有效地促进芜菁黄花叶病毒属等病毒对细胞的粘附，也有效地促进细胞对生物材料的粘附。
技术实现思路
本专利技术提供了一种融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒、感染性克隆及其制备方法和应用，解决现有PCV2疫苗产生的抗体效价低，免疫空白期长，猪群病毒载量降低比例较差的技术问题。本专利技术采用的技术方案如下：一种融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒，RGD短肽融合于PCV2Cap蛋白上。进一步地，RGD短肽插入到PCV2Cap蛋白LoopCD区域。进一步地，融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒是通过构建重组质粒pET100-PCV2Cap-iRGD表达获得，重组质粒pET100-PCV2Cap-iRGD氨基酸序列如SEQIDNO：14所示。根据本专利技术的另一方面，还提供了一种融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：针对LoopCD区域的突变体，利用Oligo7.0设计引物；以pET100-PCV2-DNLSCap为模板，利用over-lapPCR技术和胶回收扩增突变体的目的片段；将目的片段插入到载体中得到重组表达质粒pET100-PCV2Cap-iRGD；将重组表达质粒转化进入感受态细胞中得到重组基因工程菌；将重组基因工程菌进行分离、纯化获得重组蛋白；将重组蛋白体外组装获得融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒。进一步地，引物包括：引物F1-NdeI-001核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，引物R1-003核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；引物F2-004核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，引物R2-BamHI-007核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。根据本专利技术的另一方面，还提供了一种药物组合物或疫苗，包括上述融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒，还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。根据本专利技术的另一方面，还提供了一种如上述融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗，用于预防或治疗由PCV2感染导致的疾病。根据本专利技术的另一方面，还提供了一种突变型感染性克隆，由以1.1拷贝且含有两个Stem-loop的PCV2全基因组的质粒为模板，在其全长Cap基因的N端的LoopCD区域插入RGD序列构建所得。根据本专利技术的另一方面，还提供了一种如上述突变型感染性克隆在制备具有遗传标记的病毒毒株的应用。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的融合RGD的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒，通过对PCV2Cap蛋白进行了RGD多肽序列短肽修饰，并在体外组装成表面融合RGD的PCV2病毒样颗粒。与野生型PCV2病毒样颗粒相比，融合RGD的PCV2病毒样颗粒免疫小鼠产生的PCV2特异性IgM和IgG抗体水平显著升高，能诱导产生高滴度的PCV2抗体，融合RGD的PCV2病毒样颗粒增强体液免疫应答。融合RGD的PCV2病毒样颗粒可应用于增强型VLPs和鉴别诊断的分子标签VLPs疫苗研制，为PCV2疫苗的研发提供了新思路。本专利技术的突变型感染性克隆，由以1.1拷贝且含有两个Stem-loop的PCV2全基因组的质粒为模板，在其全长Cap基因的N端的LoopCD区域插入RGD序列构建所得。突变型感染性克隆在PK-15细胞中能够进行复制，而且与1.1拷贝的野生型PCV2感染性克隆病毒比，突变型感染性克隆毒株基因组拷贝数增加。除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本专利技术还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本专利技术作进一步详细的说明。附图说明构成本申请的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术的PCV2Cap突变体设计示意图；图2是本专利技术优选实施例的野生型及突变型PCV2核衣壳蛋白3D结构示意图；图3是本专利技术优选实施例的重组质粒酶切鉴定示意图；图4是本专利技术优选对比例1的重组质粒测序图谱；图5是本专利技术优选实施例1的重组质粒测序图谱；图6是本专利技术纯化蛋白的SDS-PAGE鉴定图；图7是本专利技术纯化蛋白的Westernblot鉴定图；图8是本专利技术野生型WT-VLPs凝胶渗透色谱法鉴定结果图；图9是本专利技术优选实施例1组装的VLPs凝胶渗透色谱法鉴定结果图；图10是本专利技术对比例1组装的VLPs凝胶渗透色谱法鉴定结果图；图11是本专利技术的VLPs的电镜图；图12是本专利技术的VLPs入侵细胞的IFA图；图13是本专利技术的小鼠血清中PCV2Cap特异性lgM抗体水平的检测示意图；图14是本专利技术的小鼠血清中PCV2Cap特异性lgG抗体水平的检测示意图；图15是本专利技术的的突变型感染性克隆设计示意图；图16是本专利技术优选实施例的重组质粒pSP72-PCV2-iRGD酶切鉴定图；以及图17是本专利技术优选实施例的突变型感染性克隆病毒拷贝数测定结果图。其中，WT-Cap代表为PCV2Cap蛋白；iRGD-Cap代表为85G和86S之间插入含有一个拷贝的RGD序列(即SRGDG序列)的融合RGD的突变体蛋白；rRG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，其特征在于，/n所述RGD短肽融合于PCV2 Cap蛋白上。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，其特征在于，
所述RGD短肽融合于PCV2Cap蛋白上。


2.根据权利要求1所述的融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，其特征在于，
所述RGD短肽插入到PCV2Cap蛋白LoopCD区域。


3.根据权利要求1所述的融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，其特征在于，
所述融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒是通过构建重组质粒pET100-PCV2Cap-iRGD表达获得，所述重组质粒pET100-PCV2Cap-iRGD氨基酸序列如SEQIDNO：14所示。


4.一种融合RGD的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
针对LoopCD区域的突变体，利用Oligo7.0设计引物；以pET100-PCV2-DNLSCap为模板，利用over-lapPCR技术和胶回收扩增突变体的目的片段；
将目的片段插入到载体中得到重组表达质粒pET100-PCV2Cap-iRGD；
将所述重组表达质粒转化进入感受态细胞中得到重组基因工程菌；
将所述重组基因工程菌进行分离、纯化获得重组蛋白；
将所述重...

【专利技术属性】
技术研发人员：王乃东，蒋一凡，王东亮，湛洋，李周勉，袁晓民，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43