一种新型钙螯合肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种新型钙螯合肽及其制备方法和应用。所述钙螯合肽的氨基酸序列：YQEPVIAPKL。本发明专利技术提供的钙螯合肽安全无毒，与传统补钙剂相比具有更好的理化活性，其钙螯合能力达28.4mg/g；可在提高钙在人体中的吸收和生物利用率的同时，也可补充胶原蛋白肽，且可促进Caco‑2小肠上皮细胞中钙吸收和转运，用作药物开发以及生物补钙剂的原料。本发明专利技术提供的制备方法成功得到该钙螯合肽，可充分利用鱼产品资源，操作简单，为罗非鱼骨的高值化利用提供了新途径。

A new calcium chelating peptide and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种新型钙螯合肽及其制备方法和应用
本专利技术属于功能性保健食品制备
，具体涉及一种新型钙螯合肽及其制备方法和应用。
技术介绍
中国是世界上最大的罗非鱼养殖和出口国。随着饮食习惯的改变，消费者更喜欢食用加工过的鱼，因为食用更方便。2017年，中国罗非鱼加工贸易量约67万吨。肉类是罗非鱼的主要产品，而罗非鱼骨成为副产品，如果不能有效利用，会对环境造成污染。研究表明，每30万吨罗非鱼可以获得4.29万吨鱼骨。鱼骨中含有丰富的胶原蛋白(约40.8％)和钙(2.72％)，是骨胶原和矿物质的重要来源。钙是人体必需的营养物质，在骨骼生长、细胞内代谢、肌肉收缩、凝血和骨骼结构支持等方面发挥着重要作用。充足的钙摄入量对于保持骨密度和提供最大限度的保护，防止负钙平衡是必不可少的，特别是对老年人。从饮食中摄取钙是身体补充骨骼中钙的唯一来源。十二指肠近端和空肠中可溶性钙的含量决定了人体对钙的吸收量。然而，它受到一些形成钙不溶性盐的饮食因素的影响，如植酸、草酸和单宁酸，以及肠道的碱性pH值。近年来的研究发现，氨基酸组成具有一定特征的肽可以螯合钙，提高钙的生物利用度。例如，从章鱼碎屑、酪蛋白和裂殖酵母蛋白水解物中提取的肽可以螯合钙，形成肽-钙复合物，增强Caco-2细胞对钙的吸收。此外，有研究报道钙螯合肽可提高大鼠对钙的吸收，如太平洋鳕鱼骨胶原肽、鲫鱼皮胶原蛋白肽、脱盐鸭蛋清肽等。罗非鱼骨是生产生物活性肽的理想原料。由于其成本低，蛋白质含量高。人们对鱼骨的广泛利用进行了大量的研究，特别是对鱼骨钙结合能力的利用。然而，关于罗非鱼骨单体肽的生物利用度的研究还很少。因此，针对罗非鱼骨开发一种具有较好生物利用度的单体肽以实现罗非鱼骨的进一步具有重要的研究意义和经济价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有关于罗非鱼骨单体肽的生物利用度的研究缺乏的缺陷或不足，提供一种新型钙螯合肽。本专利技术提供的新型钙螯合肽具有较好的钙螯合活性，其钙螯合能力达28.4mg/g，且可促进Caco-2细胞单层中钙转运，可用于制备补钙制剂或功能性饮料，提高钙在人体中的吸收和生物利用率的同时，也可补充胶原蛋白肽，满足人体对钙元素摄入量的需求。本专利技术的另一目的在于提供上述钙螯合肽的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供上述钙螯合肽在制备补钙制剂或功能性饮料中的应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种钙螯合肽，所述钙螯合肽的氨基酸序列为：YQEPVIAPKL(Tyr-Gln-Glu-Pro-Val-Ile-Ala-Pro-Lys-Leu)。本专利技术提供的钙螯合肽安全无毒，与传统补钙剂相比具有更好的理化活性，其钙螯合能力达28.4mg/g，且可促进Caco-2细胞单层中钙转运，可在提高钙在人体中的吸收和生物利用率的同时，也可补充胶原蛋白肽，用作药物开发以及生物补钙剂的原料，满足人体对钙元素摄入量的需求。优选地，所述钙螯合肽的分子量为1157.627Da。上述钙螯合肽的制备方法，包括如下步骤：S1：将罗非鱼骨架进行酶解脱肉，碱洗脱脂，脱钙处理和酸处理后得到罗非鱼骨胶原蛋白；S2：将S1所得罗非鱼骨胶原蛋白酶解后，灭酶，离心取上清液冻干；S3：利用制备型反相高效液相色谱进行多级逐级分离纯化后，利用分析型高效液相分离即得到所述钙螯合肽。本专利技术为以钙螯合活性为评价指标，采用制备型反相高效液相色谱和分析型高效液相色谱对罗非鱼骨胶原蛋白酶解产物进行分离纯化，即得到罗非鱼骨胶原蛋白源的钙螯合肽。本专利技术提供的制备方法成功得到该钙螯合肽，可充分利用鱼产品资源，操作简单，为罗非鱼骨的高值化利用提供了新途径。优选地，S1在酶解脱肉前还包括将罗非鱼骨架解冻，去除杂质，清洗干净，，及鱼骨架去头的步骤。优选地，S1中所述酶解脱肉的过程为：将罗非鱼骨架切段，用中性蛋白酶酶解后，去除罗非鱼骨架上的碎肉。更为优选地，S1中将罗非鱼骨架切成4～7cm的段状；所述中性蛋白酶酶解的时间为1～3h，温度为45～60℃，pH为7～8。更为优选地，所述中性蛋白酶的质量浓度为5g/mL；中性蛋白酶和罗非鱼骨架的质量比为1:200；酶解的时间为2h，温度为55℃，pH为7.5。酶解结束后洗去杂质。优选地，S1中所述碱洗脱脂的过程为：利用无机碱性溶液清洗脱脂，然后清洗至中性。更为优选地，所述无机碱性溶液为氢氧化钠溶液。具体地，S1中所述碱洗脱脂的过程为：将鱼骨放入0.1mol/LNaOH溶液(w/v1:10)搅拌24h，清洗至中性。优选地，S1中所述脱钙处理的过程为：将碱洗脱脂后罗非鱼骨置于EDTA-2Na溶液中，冷冻，搅拌，清洗至中性。更为优选地，所述EDTA-2Na溶液的pH为7.2，所述罗非鱼骨和EDTA-2Na溶液的质量体积比为1:10。具体地，脱钙处理的过程为：将鱼骨放入10％EDTA-2Na(pH7.2，w/v1:10)中，并置于4℃冷库中，期间进行搅拌处理5day，随后将鱼骨清洗至中性后待用。优选地，S1中所述酸处理的过程为：脱钙后的鱼骨用酸性溶液处理后水洗至中性，即得到罗非鱼骨胶原蛋白。更为优选地，所述酸性溶液为4％的盐酸溶液；所述酸处理的时间为18h。优选地，S2中选用木瓜蛋白酶进行酶解；所述木瓜蛋白酶在酶解体系的质量分数为0.3～1％；所述酶解的时间为3～6h；所述酶解的温度为40～60℃；所述酶解的pH为6～7，。更为优选地，所述木瓜蛋白酶在酶解体系的质量分数为1％；所述酶解的时间为5h；所述酶解的温度为60℃；所述酶解的pH为7.0，木瓜蛋白酶和罗非鱼骨胶原蛋白的酶底比1％。优选地，S3中所述制备型高效液相色谱包括二级逐级分离纯化。更为优选地，制备型高效液相色谱第一级分离的条件为：进样量为4000μL；色谱柱为C18色谱柱；流动相A为含有0.1％的TFA的水溶液，流动相B为含0.1％TFA的乙腈溶液；洗脱速度为10.0mL/min；紫外检测波长为双检测波长：214nm、280nm；洗脱条件为：0～10min：流动相B：6％～10％，10～60min：流动相B：28％，60～65min：流动相B：28％～90％，65～75min：流动相B：90％，75～80min，流动相B：90％～6％，80～90min：流动相B：6％。更为优选地，制备型高效液相色谱第二级分离的条件为：进样量为1000μL；色谱柱为C18色谱柱；流动相A为含有0.1％的TFA的水溶液，流动相B为含0.1％TFA的乙腈溶液；洗脱速度为10.0mL/min；紫外检测波长为双检测波长：214nm、280nm；洗脱条件为：0～40min：流动相B：5％～25％，40～45min：流动相B：25％～90％，40～45min：流动相B：25％～90％，45～50min：流动相B：90％，50～55min，流动相B：90％～5％，55～65min：流动相B：5％。优选地，S3中所述分析型高效本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型钙螯合肽，其特征在于，所述钙螯合肽的氨基酸序列为：YQEPVIAPKL。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型钙螯合肽，其特征在于，所述钙螯合肽的氨基酸序列为：YQEPVIAPKL。


2.根据权利要求1所述新型钙螯合肽，其特征在于，所述钙螯合肽的分子量为1157.627Da。


3.权利要求1～2任一所述新型钙螯合肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将罗非鱼骨架进行酶解脱肉，碱洗脱脂，脱钙处理和酸处理后得到罗非鱼骨胶原蛋白；
S2：将S1所得罗非鱼骨胶原蛋白酶解后，灭酶，离心取上清液冻干；
S3：利用制备型反相高效液相色谱进行多级逐级分离纯化后，利用分析型高效液相分离即得到所述钙螯合肽。


4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，S1中所述酶解脱肉的过程为：将罗非鱼骨架切段，用中性蛋白酶酶解后，去除罗非鱼骨架上的碎肉。


5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，S1中所述碱洗脱脂的过程为：利用无机碱性溶液清洗脱脂，然后清洗至中性。


6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，S1中所述脱钙处理的过程为：将碱洗脱脂后罗非鱼骨置于EDTA-2Na溶液中，冷冻，搅拌，清洗至中性。

【专利技术属性】
技术研发人员：苗建银，廖婉雯，曹庸，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44