一种人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法，包括步骤：S1.培养人绒毛膜癌JAR细胞：S2.选取雌性裸鼠，于裸鼠右侧腹股沟部位注射人绒毛膜癌JAR细胞悬液200ul；待肿瘤生长至体积达到2cm

A construction method of orthotopic tumor model of human choriocarcinoma in nude mice

【技术实现步骤摘要】
一种人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法。
技术介绍
绒毛膜癌，简称绒癌，是一种继发于正常或异常妊娠之后的恶性滋养细胞肿瘤，常继发于葡萄胎、流产或足月分娩以后。少数可发生于异位妊娠后，多为生育年龄妇女。偶尔发生于未婚妇女的卵巢称为原发性绒毛膜癌。绒癌具有高度侵袭性的特点，是一种高度攻击性疾病，其远处转移部位以肺、脑、肝为常见。目前绒癌的治疗策略主要采用化疗和手术切除的方法，但化疗反应大，仍有部分患者因耐受或因不能承受化疗毒副作用而死亡。近年来，学者们对肿瘤模型的研究更加重视，其中裸鼠动物模型为抗肿瘤药物的体内研究提供了合适的实验对象。皮下移植瘤模型是常见的肿瘤动物模型，但其与临床实际拟合度较低。原位移植瘤是指将人癌细胞或组织移植入动物体内的肿瘤原发器官，模拟肿瘤细胞生长微环境，更契合临床上肿瘤的发生发展。本研究首先建立裸鼠绒癌皮下移植瘤模型，再将绒癌组织移植到健康裸鼠子宫内，首次成功地建立了人绒毛膜癌原位移植模型，为进一步探讨人绒毛膜癌的发病机制和临床治疗奠定了良好基础。虽然裸鼠皮下移植瘤在绒癌的研究中是目前最常使用的动物模型，但遗憾的是皮下移植瘤与绒癌的临床实际进展情况有一定差异，不能完整地保留人绒癌的生物学特性。而目前国内外尚未见绒癌裸鼠原位移植瘤模型构建的报道，也没有裸鼠模型能够复制绒癌的进展过程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提出一种人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法，以实现首次构建人绒癌裸鼠原位移植瘤模型。本专利技术提供的人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法，通过模拟肿瘤细胞生长微环境，契合临床上肿瘤的发生发展，为进一步探讨人绒毛膜癌的发病机制和临床治疗奠定了良好基础。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法，包括以下步骤：步骤S1.培养人绒毛膜癌JAR细胞：采用含10％胎牛血清的DMEM培养，置于环境温度37℃、质量分数为5％的CO2环境的培养箱中，每2天更换一次培养液，待细胞密度汇合至约80％～90％，用0.25％胰酶消化细胞，离心去上清液后，用生理盐水重新混悬成单细胞悬液，调整细胞密度，得到人绒毛膜癌JAR细胞悬液；步骤S2.皮下移植瘤模型的建立：选取雌性裸鼠，于裸鼠右侧腹股沟部位注射人绒毛膜癌JAR细胞悬液200ul，注射细胞数量为(0.95～1.05)×107个/只，优选地，注射细胞数量为1×107个/只；待肿瘤生长至体积达到2cm3时，摘取肿瘤组织；步骤S3.原位移植瘤模型的建立：在无菌条件下，从获得的肿瘤组织选择新鲜、活力较好的绒癌组织，无菌生理盐水漂洗2～3次后，切成1mm3组织块，放入无菌生理盐水中待用；选取雌性裸鼠，术前12h禁食、6h禁水，采用水合氯醛对裸鼠全身麻醉，取腹部正中纵形切口，无齿镊游离腹腔内脏器，充分暴露子宫，手术尖刀划开子宫壁，将绒癌组织块移植入子宫体腔内，可吸收缝合线缝合子宫壁，并逐层缝合、关腹；术后继续饲养，自由进食，即在裸鼠体内建立人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型。进一步地，所述雌性裸鼠选取BALB/c雌性裸鼠。进一步地，所述雌性裸鼠的饲养条件为SPF级，温度为22℃～25℃，相对湿度为40％～60％，每日光照12h。进一步地，在步骤S2中，摘取肿瘤组织的具体过程为：保持肿瘤组织取材的无菌操作，操作应该在无菌超净台内，碘伏消毒移植瘤部位及周围皮肤。进一步地，在步骤S2中，在选取和保存肿瘤组织过程中，选取鲜活、无出血坏死的瘤组织块，生理盐水冲洗后放入含生理盐水的无菌EP管中，置于冰盒中保持组织新鲜状态。进一步地，在步骤S3中，选取10周龄雌性裸鼠作为实验对象。通过以10周龄雌性裸鼠作为实验对象，该阶段裸鼠子宫发育成熟，符合绒癌好发于成年女性的特征，且易于手术操作，此外此阶段裸鼠自然杀伤细胞的活性低，移植成功率更高；有效避免因周龄过小，裸鼠的子宫过小导致手术不易操作，且手术耐受能力差，手术失败率和死亡率高等问题发生。进一步地，在步骤S3中，采用质量分数为4％水合氯醛，以(0.95～0.15)mL/10g的剂量对裸鼠进行全身麻醉。优选地，以0.1mL/10g的剂量对裸鼠进行全身麻醉。在使用操作过程中，通过采用质量分数为4％水合氯醛，以0.1mL/10g的剂量对裸鼠进行全身麻醉，严格根据体重计算麻醉计量，避免因剂量过大导致死亡，剂量过小导致不能进行深麻等问题发生，影响手术进程；另外，在术前12h禁食、6h禁水，预防手术期间胃内容物反流、误吸，增加手术操作难度，甚至导致裸鼠死亡。进一步地，在对裸鼠进行手术前，对手术器械进行消毒灭菌、高温高压烘干。进一步地，在步骤S3，术后，将裸鼠放置在35℃恒温水循环板上饲养、观察，待裸鼠状况直至体温恢复正常，能爬动时，再放入笼具内继续定期观察。通过选取35℃恒温水循环板来饲养裸鼠，有效帮助裸鼠在术后快速恢复体温。进一步地，在术后的前三天，每日早中晚各观察一次裸鼠生命体征及伤口愈合程度，之后每天观察一次。本专利技术的有益效果是：本专利技术提出的人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法，通过模拟肿瘤细胞生长微环境，契合临床上肿瘤的发生发展，为进一步探讨人绒毛膜癌的发病机制和临床治疗奠定了良好基础，经病理组织学鉴定，构建的裸鼠原位移植瘤组织学特征完全符合绒癌病理学特征。附图说明图1为本专利技术试验例中绒癌皮下移植瘤裸鼠外观图；图2为本专利技术试验例中绒癌皮下移植瘤裸鼠的瘤体；图3为本专利技术试验例中原位移植瘤裸鼠的子宫原位移植瘤和腹膜转移瘤解剖图；图4为本专利技术试验例中原位移植瘤裸鼠子宫原位移植瘤解剖图；图5为图4中子宫切除分离后的解剖图；图6为本专利技术试验例中裸鼠皮下移植瘤HE染色图；图7为本专利技术试验例中裸鼠子宫原位移植瘤HE染色图；图8为本专利技术试验例中裸鼠腹膜转移瘤HE染色图；图9为本专利技术试验例中JAR细胞爬片HE染色图；图10为本专利技术试验例中对β-HCG在皮下移植瘤中的免疫组织化学染色图；图11为本专利技术试验例中对β-HCG在子宫原位移植瘤中的免疫组织化学染色图；图12为本专利技术试验例中对β-HCG在腹膜转移瘤中的免疫组织化学染色图；图13为本专利技术试验例中对β-HCG在阴性对照组中的免疫组织化学染色图。具体实施方式下面结合具体实施例和附图进一步详细描述本专利技术的技术方案，但本专利技术的保护范围不局限于以下所述。实施例一种人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法，包括以下步骤：步骤S1.培养人绒毛膜癌JAR细胞：采用含10％胎牛血清的DMEM培养，置于环境温度37℃、质量分数为5％的CO2环境的培养箱中，每2天更换一次培养液，待细胞密度汇合至约80％～90％，用0.25％胰酶消化细胞，离心去上清液后，用生理盐水重新混悬成单细胞悬液，调整细胞密度，得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤S1.培养人绒毛膜癌JAR细胞：采用含体积分数10％的胎牛血清的DMEM培养，置于环境温度37℃、质量分数为5％的CO

【技术特征摘要】
1.一种人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1.培养人绒毛膜癌JAR细胞：采用含体积分数10％的胎牛血清的DMEM培养，置于环境温度37℃、质量分数为5％的CO2环境的培养箱中，每2天更换一次培养液，待细胞密度汇合至80％～90％，用0.25％胰酶消化细胞，离心去上清液后，用生理盐水重新混悬成单细胞悬液，调整细胞密度，得到人绒毛膜癌JAR细胞悬液；
步骤S2.皮下移植瘤模型的建立：选取雌性裸鼠，于裸鼠右侧腹股沟部位注射人绒毛膜癌JAR细胞悬液200ul，注射细胞数量为(0.95～1.05)×107个/只；待肿瘤生长至体积达到2cm3时，摘取肿瘤组织；
步骤S3.原位移植瘤模型的建立：在无菌条件下，从获得的肿瘤组织选择绒癌组织样本，无菌生理盐水漂洗后，切成绒癌组织块，放入无菌生理盐水中待用；选取雌性裸鼠，全身麻醉，取腹部正中纵形切口，无齿镊游离腹腔内脏器，充分暴露子宫，手术尖刀划开子宫壁，将绒癌组织块移植入子宫体腔内，缝合子宫壁，并逐层缝合、关腹。


2.根据权利要求1所述的一种人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法，其特征在于，在步骤S3中，无菌生理盐水对选取的绒癌组织样本漂洗2～3次，然后切成1mm3的绒癌组织块；所选取的雌性裸鼠，术前12h禁食、6h禁水，采用水合氯醛对裸鼠全身麻醉，采用可吸收缝合线缝合子宫壁；术后继续饲养，自由进食。


3.根据权利要求1所述的一种人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型的构建方法，其特征在于，在步骤S1中，所述雌性裸鼠选取BALB/c雌性裸鼠。


4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玉红，范文静，刘镭，冯品，许倩，鲁艳杰，左彦珍，李晓茹，
申请(专利权)人：承德医学院，
类型：发明
国别省市：河北;13