便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测方法技术

本发明专利技术公开了一种便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测方法。通过纳米免疫磁珠技术和胶体金免疫层析技术的联合使用快速检测MRSA，具体如下：纳米磁珠上偶联了通过杂交瘤技术得到的单抗，形成纳米免疫磁珠；以胶体金标记的另一配对单抗为标记抗体，将多抗血清和羊抗鼠IgG分别作为检测线T和质控线C；含有胶体金标记抗体的结合垫、含有检测线T和质控线C的层析膜、吸水垫这三者组成了胶体金免疫层析试纸；检测样品时，将免疫磁珠与样品中菌体进行特异性的捕获富集，再将其富集液体加入裂解液中进行裂解，然后再将裂解液滴在试纸的样品垫上，依据胶体金的颜色在检测线T和质控线C处形成肉眼可见显色条带的判读，从而实现MRSA的快速半定量检测。

A portable MRSA method for the detection of mastitis in lactation

【技术实现步骤摘要】
便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测方法
本专利技术属于医疗检测
，具体是指一种便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测方法。
技术介绍
MRSA是哺乳期乳腺炎顽固的致病菌，该产品的研制目的是为了及早诊断及早治疗，提高疾病的治愈率，减少治疗过程中对乳房带来的损伤。目前临床上尚未有快速检出乳汁中MRSA的便携式技术产品。免疫磁珠富集技术以磁性微球为固相表面，结合免疫学方法建立了一种具有重要应用前景的样品浓缩的方法。磁珠是通过结合抗体而形成免疫磁珠，在液相中可特异性地与相应的抗原结合，依靠磁场的作用力使所需的样本量迅速浓缩。根据磁珠表面偶联的不同抗体，免疫磁珠能在短时间内富集各种类型的抗原，如分子量极小的核酸、小分子毒素、特异性蛋白、细胞或致病微生物。1、磁珠的结构结构上来说，它分为三部分，核心部分由磁性物质构成，如γFe2O3、Fe3O4和MeFe2O3，使磁性微球在磁场作用下能快速聚集；外层由聚苯乙烯、聚乙烯亚胺或聚丙烯酸等高分子材料包裹，保证磁性的密封性良好，不易出现漏磁现象；微球表面还覆盖有特殊的活化基团，常见的化学基团有羧基、氨基、巯基、甲苯磺酸基和环氧基等，能通过共价结合抗体蛋白上的氨基或羧基基团。2、磁珠的制备在医学诊断、治疗方面，多选用纳米级的免疫磁珠，因为纳米级每单位重量具有更大的表面积，分散性更好，对磁场的反应性极敏捷。用于制备免疫磁珠的抗体可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体，单抗特异性较好，利于富集后直接用于检测或分选细胞；多抗的亲和力往往高于单抗，易于捕获抗原，但由于其表位较多，对于富集抗原后的处理，较单抗复杂。缓冲液的体系主要依据磁珠表面活化基团的特点进行选择，一般选择离子浓度较低的缓冲体系，并加入0.5％吐温-20以减少磁珠聚集现象；缓冲液pH通常在pH5～pH9.5之间，过酸或过碱都会影响抗体的活性，不建议采用。对于反应温度、时间和环境，常作为相关因素考虑。反应温度越低，偶联时间越长，常见的反应条件是4℃过夜、室温反应3小时或37℃1小时。制备后的免疫磁珠表面仍存在较多未结合抗体的位点，因此需要以一些不与抗原反应的小分子把表面活性位点封闭，以减少富集过程中的非特异性吸附。常用的封闭剂有BSA、吐温-20、明胶和甘氨酸。3、优点操作步骤简单省时：磁珠富集过程高保真通(通过磁场作用浓缩样品的免疫磁珠富集法能使所需物质高度浓缩，并且在富集过程，不破坏其生物学活性)；高特异性富集；有助于提高检测限(免疫磁珠富集技术能从上游的样品前处理步骤中使目的检测物浓度大大提高，从而间接地降低了整套检测方法的检测限)。4、不足抗体在偶联磁珠后活性、亲和力和效价有所降低往往会影响下游技术应用的效果，成为制约此富集技术应用的一个关键因素。因此，优化免疫磁珠制备方法，确保抗体偶联后保持良好活性和亲和力是应用此项富集技术的重要环节。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是提供一种便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测方法，通过改善富集条件及提高抗体活性，以PB2a(MRSA产生的β内酰胺酶)以及QacA(MRSA的多药泵出蛋白)为抗原，选择特异性抗体制作磁珠，以高特异性、快速、方便检出乳汁中MRSA。为实现上述目的，本专利技术提供的便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测方法，其特征在于：通过免疫纳米磁珠技术和胶体金免疫层析技术的联合使用快速检测MRSA，纳米磁珠上偶联了通过杂交瘤技术得到的单抗，形成纳米免疫磁珠；以胶体金标记的另一配对单抗为标记抗体，将多抗血清和羊抗鼠IgG分别作为检测线T和质控线C，具体为：采用便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测试剂盒进行检测，所述便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测试剂盒包括纳米免疫磁珠、强力磁铁、金黄色葡萄球菌裂解液和胶体金免疫层析试纸；所述胶体金免疫层析试纸含有胶体金标记抗体的结合垫、含有检测线T和质控线C的层析膜和吸水垫，检测样品时，将纳米免疫磁珠与样品中菌体进行特异性的捕获富集，再将其富集液体加入裂解液中进行裂解，然后再将裂解液滴在胶体金免疫层析试纸的样品垫上，依据胶体金的颜色在检测线T和质控线C处形成肉眼可见显色条带的判读，从而实现MRSA的快速半定量检测。作为优选方案，所述待检样本与纳米磁珠体积比为20:1、10:1、5：1或2:1；所述纳米免疫磁珠捕获富集菌体方法如下：取样品与自制的免疫磁珠在充分震荡混匀后，静置反应30-60min，然后进行磁场分离，经过PBS洗涤3次，即可得到菌体富集液；所述细菌裂解液与待检样本体积比为1:20、1:10或1:1；将得到裂解液液滴在检测区内，待5-15min后读取T、C线的显色，得到结果。进一步地，采用便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测试剂盒进行检测，包括如下步骤：(2.1)待测样品与纳米免疫磁珠吸附：在容器中依此加入纳米免疫磁珠、待检样本，混合均匀后在25-40℃中反应30-60min；(2.2)磁铁将纳米磁珠吸引聚拢：将盛有上一步所用容器放在一个强力磁铁上静置3min，然后倒掉其中的液体；(2.3)裂解细菌：向容器中加50ul/ml的金黄色葡萄球菌裂解液，继续在25-40℃中反应30-60min；(2.4)显色：将裂解液倒入胶体金免疫层析试纸样品垫上，层析10-15min观察颜色变化，若呈现两条深红色条带则为强阳性，提示耐药金黄色色葡萄球菌感染；若呈现一深一浅提示弱阳性，有耐药金黄色色葡萄球菌感染的可能性；若只呈现有一条红色条带则不支持耐药金黄色葡萄球菌感染；若没有呈现红色条带则提示损坏。更进一步地，所述纳米免疫磁珠的制备步骤如下：(3.1)抗体的制备与纯化：以高压灭菌处理MRSA作为抗原免疫小鼠，选取Balb/c，雌性小鼠；其中，抗原注射量为每只小鼠100-200ug，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单克隆抗体细胞株，进而将抗MRSA的特异性抗体细胞株增殖培养，注射到小鼠体内制备腹水，所得腹水经辛酸-硫酸铉沉淀法进行抗体纯化；以高压灭菌处理MRSA菌体作为抗原免疫新西兰大白兔，所得抗MRSA血清经硫酸铉沉淀法进行纯化，所得多克隆抗体保存于-80℃待用；(3.2)纳米磁珠与抗体的偶联：选用颗粒直径为10-800nm的纳米磁性粒子，按照纳米免疫磁珠:金黄色葡萄球菌蛋白AIgG＝15:1的质量比，将两者震荡混匀6h；然后按照特异性抗体:硼氢化钠＝1:1的质量比加入硼氢化钠，得到特异性抗体偶联的纳米免疫磁珠，用过柱法纯化，于4℃保存。更进一步地，所述纳米磁性的粒子颗粒直径为60-300nm。(二)本专利技术所述的胶体金免疫层析试纸条制备步骤如下：所述胶体金免疫层析试纸包括吸水纸(样品垫)(1)、玻璃纤维膜(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水纸(4)，所述吸水纸(样品垫)(1)、玻璃纤维膜(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水纸(4)首尾互相衔接；所述玻璃纤维膜(2)上吸附着干燥的金标抗体(流动带)；所述硝酸纤维素膜(3)上包被着抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测方法，其特征在于：通过免疫纳米磁珠技术和胶体金免疫层析技术的联合使用快速检测MRSA，纳米磁珠上偶联了通过杂交瘤技术得到的单抗，形成纳米免疫磁珠；以胶体金标记的另一配对单抗为标记抗体，将多抗血清和羊抗鼠IgG分别作为检测线T和质控线C，具体为：/n采用便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测试剂盒进行检测，所述便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测试剂盒包括纳米免疫磁珠、强力磁铁、金黄色葡萄球菌裂解液和胶体金免疫层析试纸；所述胶体金免疫层析试纸含有胶体金标记抗体的结合垫、含有检测线T和质控线C的层析膜和吸水垫，检测样品时，将纳米免疫磁珠与样品中菌体进行特异性的捕获富集，再将其富集液体加入裂解液中进行裂解，然后再将裂解液滴在胶体金免疫层析试纸的样品垫上，依据胶体金的颜色在检测线T和质控线C处形成肉眼可见显色条带的判读，从而实现MRSA的快速半定量检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测方法，其特征在于：通过免疫纳米磁珠技术和胶体金免疫层析技术的联合使用快速检测MRSA，纳米磁珠上偶联了通过杂交瘤技术得到的单抗，形成纳米免疫磁珠；以胶体金标记的另一配对单抗为标记抗体，将多抗血清和羊抗鼠IgG分别作为检测线T和质控线C，具体为：
采用便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测试剂盒进行检测，所述便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测试剂盒包括纳米免疫磁珠、强力磁铁、金黄色葡萄球菌裂解液和胶体金免疫层析试纸；所述胶体金免疫层析试纸含有胶体金标记抗体的结合垫、含有检测线T和质控线C的层析膜和吸水垫，检测样品时，将纳米免疫磁珠与样品中菌体进行特异性的捕获富集，再将其富集液体加入裂解液中进行裂解，然后再将裂解液滴在胶体金免疫层析试纸的样品垫上，依据胶体金的颜色在检测线T和质控线C处形成肉眼可见显色条带的判读，从而实现MRSA的快速半定量检测。


2.根据权利要求1所述的便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测方法，其特征在于：所述待检样本与纳米磁珠体积比为20:1、10:1、5：1或2:1；所述纳米免疫磁珠捕获富集菌体方法如下：取样品与自制的免疫磁珠在充分震荡混匀后，静置反应30-60min，然后进行磁场分离，经过PBS洗涤3次，即可得到菌体富集液；
所述细菌裂解液与待检样本体积比为1:20、1:10或1:1；将得到裂解液液滴在检测区内，待5-15min后读取T、C线的显色，得到结果。


3.根据权利要求1或2所述的便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测方法，其特征在于：采用便携式哺乳期乳腺炎致病菌MRSA检测试剂盒进行检测，包括如下步骤：
(2.1)待测样品与纳米免疫磁珠吸附：在容器中依此加入纳米免疫磁珠、待检样本，混合均匀后在25-40℃中反应30...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈创，刘辉凡，吴淑娟，谭细容，刘长江，张智辉，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42