以ANKRD22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种以ANKRD22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用，以ANKRD22为靶标是指包括采用基因敲除、基因敲减或者化学药物降低ANKRD22基因的表达。本发明专利技术为修复胃肠粘膜轻中度损伤提供了一种新的靶标，即通过抑制ANKRD22基因表达，不仅能够使胃组织LGR5+干细胞扩增，而且能够减轻胃组织炎症反应，增加胃粘液分泌。

The application of ankrd22 as the target in the preparation of protective agent for gastrointestinal mucosa repair

【技术实现步骤摘要】
以ANKRD22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及以ANKRD22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用。
技术介绍
胃肠道是人体重要的消化和吸收器官，食物需要胃的充分研磨与胃酸混匀后才能形成可供小肠吸收的糊状食糜。胃肠粘膜虽可保护胃免受损伤，但极易受到饮食、药物和不良情绪等的损伤。胃肠粘膜损伤是世界范围内的常见病和多发病，几乎所有人在一生中都罹患此疾病。随着现在人们社交活动的增加，酒精、刺激性食物等外源性损伤因素引起的胃肠粘膜损伤相关疾病发病率也在逐年增加，尤其是酒精引起的轻中度胃肠粘膜损伤正日益增加。乙醇通过直接或者间接作用损伤胃肠粘膜屏障导致粘膜通透性增加、中性粒细胞浸润、自由基增加，从而出现炎症、疼痛等症状。目前，国内外学者对胃肠粘膜损伤修复进行了大量研究，探讨乙醇致胃肠粘膜损伤机制，研究防治乙醇性胃肠粘膜损伤的药物，但至今尚无国际公认的有效药物问世。临床上保护胃肠粘膜的关键手段为抑制胃酸和抗幽门螺旋杆菌，主要药物为碱性抗酸类、质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂和胃肠粘膜保护剂等。近年来，人们已经认识到加强胃肠粘膜防御功能的重要性，认为加强调胃肠粘膜保护，能对胃肠粘膜损伤修复起到积极的作用。目前胃肠粘膜保护剂的主要代表有：前列腺素类药、替普瑞酮、硫糖铝、枸橼酸铋钾等，其作用机理都不尽相同。这些药物虽然有较好的治疗效果，但有关其不良反应的报道也日益增多。因此，寻找更加安全有效的胃肠粘膜保护剂药物对于攻克这一全球性疾病具有重要意义。胃肠道组织中存在干细胞，而干细胞具有损伤修复功能。随着“提高胃肠粘膜修复质量是粘膜损伤治疗的关键”这一观念的提出，专利技术者希望通过不断探索，找到一种靶向性分子，可以特异性靶向胃组织干细胞，增强干细胞扩增能力从而修复胃肠粘膜损伤，而对正常的组织细胞不具有破坏作用。因此提供一种新型的有效提高胃肠粘膜损伤修复质量的靶标是目前亟需解决的问题。
技术实现思路
ANKRD22是一个具有4个锚蛋白重复基序(ANK)的小分子蛋白。每个ANK包含2个反向á螺旋和1个发卡样的L形结构，大小约30-34个氨基酸残基，形成高亲和的分子连接绞手架结构。体内包含ANK基序的蛋白众多，功能非常广，而ANKRD22在人体胃组织及巨噬细胞中有高表达水平，是一个联系了细胞代谢重编程和核重编程的分子，提示ANKRD22这一靶点与胃组织干细胞修复功能密切相关。通过试验发现ANKRD22与轻中度胃肠粘膜损伤修复存在关联，有可能作为胃肠粘膜损伤治疗的靶标。因此，以ANKRD22为靶标，筛选出一种新型的靶向胃组织干细胞的胃肠粘膜修复保护剂具有重要的社会意义和广阔的经济市场。有鉴于此，本专利技术的主要目的在于寻找用于修复胃肠粘膜轻中度损伤，尤其是靶向胃组织干细胞的新靶标，以更好地预防和/或治疗轻中度胃肠粘膜损伤相关疾病。本专利技术提供了一种新型的靶向干细胞的胃肠粘膜修复保护剂潜在靶标，即以ANKRD22基因为靶点在制备胃肠粘膜保护剂中的应用。ANKRD22(Ankyrinrepeatdomain-containingprotein22)，是一个具有4个锚蛋白重复基序(ANK)的小分子蛋白，在人体胃组织和巨噬细胞中有高表达水平。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：第一方面，本专利技术提供以ANKRD22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用。进一步地，所述胃肠粘膜修复保护剂为靶向胃组织干细胞的药物。进一步地，所述胃肠粘膜修复保护剂以ANKRD22为靶标，胃肠粘膜损伤修复时扩增胃组织LGR5+干细胞。进一步地，所述胃肠粘膜修复保护剂以ANKRD22为靶标，减轻胃组织炎症反应和增加胃组织黏液分泌。进一步地，以ANKRD22为靶标是指包括采用基因敲除、基因敲减或者化学药物降低ANKRD22基因的表达。第二方面，本专利技术提供以ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用。进一步地，以ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞的制备方法，包括以下步骤：S1.采用灌胃方式给ANKRD22基因缺失的小鼠进行胃肠粘膜轻中度损伤刺激；S2.在胃肠粘膜修复24-48h期间，从小鼠身上取下胃组织块，采用酶混合液对胃组织块进行消化，酶混合液包括胶原酶IV、透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶；S3.消化完成后采用胎牛血清终止消化，产物加入50ml离心管，以800rmp/min、4℃离心，将细胞沉淀用RPMI1640完全培养基重悬；S4.用Percoll等密度梯度沉淀法分离纯化胃组织巨噬细胞；S5.2500rmp/min、4℃离心后，用吸管吸出云雾状中间层细胞带；S6.加入3倍体积Percoll液的RPMI1640完全培养基稀释，800rmp/min、4℃离心后，用RPMI1640完全培养基重悬细胞沉淀，该细胞悬液即ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞。进一步地，S1中，胃肠粘膜轻中度损伤刺激中，HCl/EtOH灌胃的量为5mL/kg体重。进一步地，S2中，在胃肠粘膜修复24-48h期间，从小鼠身上取下胃组织块，采用预热至37℃的酶混合液对剪碎的胃组织块进行消化。进一步地，S2中，从小鼠身上取下胃组织块，具体包括，将脱颈处死的小鼠浸泡于75％酒精中，随后将小鼠放置于无菌超净台上，用手术剪刀和镊子取下胃组织块。进一步地，S2中，在采用酶混合液对胃组织块进行消化之前，还包括用4℃生理盐水彻底冲洗组织块的血液，用无菌剪刀剔除可见的脂肪、结缔组织，将组织块剪成1～3㎜3大小的小块，然后再进行消化。可以理解，将胃组织块剪成小块可以更好的的进行消化，提高消化的质量和效率。进一步地，S2中，酶混合液中含有50mg/mL的胶原酶I、50mg/mL的胶原酶IV、5mg/mL的透明质酸酶和1U/mL的脱氧核糖核酸酶。进一步地，S3中，消化完成后采用胎牛血清终止消化，产物加入50ml离心管，以800rmp/min、4℃离心，将细胞沉淀用RPMI1640完全培养基重悬；如果消化后上清液粘稠，可再加入脱氧核糖核酸酶消化，用胎牛血清终止反应，再次800rmp/min、4℃离心，用RPMI1640完全培养基重悬细胞沉淀，暂放入37℃孵箱中；将所有重悬的细胞悬液混合，800rmp/min、4℃离心后，用RPMI1640完全培养基重悬；进一步地，S4中，用Percoll等密度梯度沉淀法分离纯化胃组织巨噬细胞，可以具体的，用带14号长针头的玻璃注射器，按密度从大到小依次将45％和35％的Percoll溶液沿15ml离心管侧壁缓慢加入，每个梯度加3ml，操作过程中注意不要有气泡产生；将3ml的细胞悬液用吸管缓慢沿管壁加入离心管，使其铺于Percoll密度梯度的液体表面；本专利技术的一种实现方式中，用9份Percoll液与1份10*D-Hanks’液配制90％的Percoll母液，再用Percoll母液与DHanks′液配制35％和45％的Percoll溶液；进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.以ANKRD22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.以ANKRD22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胃肠粘膜修复保护剂为靶向胃组织干细胞的药物。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胃肠粘膜修复保护剂以ANKRD22为靶标，胃肠粘膜损伤修复时扩增胃组织LGR5+干细胞。


4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胃肠粘膜修复保护剂以ANKRD22为靶标，减轻胃组织炎症反应和增加胃组织黏液分泌。


5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，以ANKRD22为靶标是指包括采用基因敲除、基因敲减或者化学药物降低ANKRD22基因的表达。


6.以ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用。


7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，以ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1.采用灌胃方式给ANKRD22基因缺失的小鼠进行胃肠粘膜轻中度损伤刺激；
S2.在胃肠粘膜修复24-48h期间，从小鼠身上取下胃组织块，采用酶混合液对胃组织块进...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱永良，柳景文，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33