雄烯二酮C1,2位的生物脱氢方法技术

本发明专利技术涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体涉及一种雄烯二酮C1,2位的生物脱氢方法。本发明专利技术以4‑雄烯‑3,17‑二酮为底物，以简单诺卡氏菌菌液为酶源，同时将大豆油100‑200ml/L和吐温‑80 0.1‑2g/L加入转化体系中，于29‑31℃下进行转化反应，反应完全，反应物经分离纯化得到1,4‑雄二烯‑3,17‑二酮。本发明专利技术在采用普通直接转化法的基础上，通过加入大豆油和吐温‑80，可以大幅度提高转化率，转化率可达到96％以上；同时产物的降解率低，反应专一性强，转化时间相对较快，产品质量高；并且无需无菌环境，常规室外操作即可，操作简单，适合工业化大批量生产。

Biodehydrogenation of androstenedione at C1,2

【技术实现步骤摘要】
雄烯二酮C1,2位的生物脱氢方法
本专利技术涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体涉及一种雄烯二酮C1,2位的生物脱氢方法。
技术介绍
甾体化合物C1,2位脱氢有化学法和生物法两种，传统的化学法采用二氧化砷脱氢，工艺简单，收率可观，但产物中含有一定量的砷，不能达到有关标准的规定，而生物法具有特异性强、反应快速以及高产率等特点，所以近年来生物法已经在逐渐取代化学法。雄烯二酮C1,2位脱氢的反应过程如图1所示。雄烯二酮进行C1,2位脱氢，目前生物法中有4种反应体系：普通直接转化、双液相转化、原生质体转化以及破碎细胞转化。普通直接转化是通过直接将菌液加入发酵培养基进行转化，菌液不需要经过任何处理，但是需要无菌操作，增加了操作的难度。双液相转化技术早期主要应用在生物分子和细胞的分离纯化，近年来才逐渐应用于生物转化，该技术中关键的因素就是成相介质的选取，但选择对细胞有较好相容性的有机溶剂较为困难。原生质体转化能克服细胞膜通透性影响胞内酶催化微生物转化的困难，但是操作复杂繁琐，不利于大批量生产。超声破碎转化通过增加底物溶解性、强化传质、增加酶与底物的有效接触来提高微生物对甾体化合物的转化率，但是超声破碎对于工业生产来说难度较大。在这4种体系中，转化率最高的是普通直接转化，但也只有70％左右，导致成本居高不下。
技术实现思路
针对以上技术问题，本专利技术的目的是提供一种快速的、高纯度的、单一性强的简单诺卡氏菌微生物转化4-雄烯-3,17-二酮制备1,4-雄二烯-3,17-二酮的方法，能够解决目前雄烯二酮脱氢方法中操作复杂、转化率低和降解率高的问题。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种雄烯二酮C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述方法为：以4-雄烯-3,17-二酮为底物，以简单诺卡氏菌菌液为酶源，同时将大豆油1％-16％和吐温-800.05％-0.2％加入转化体系中，于29-31℃下进行转化反应，反应完全，反应物经分离纯化得到1,4-雄二烯-3,17-二酮。进一步地，所述底物的添加量为0.5％-10％。进一步地，所述简单诺卡氏菌菌液的制备方法为：(1)斜面培养：所述斜面培养基包括按质量体积百分数(w/v)计的以下物质：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.15％、酵母浸膏0.01-0.05％和琼脂粉0.01-2％；pH7.0-7.2，121℃灭菌30min，接种简单诺卡氏菌菌种；(2)一级种子培养：所述一级种子培养基包括按质量体积百分数(w/v)计的以下物质：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.15％和酵母浸膏0.01-0.05％；pH7.0-7.2，121℃灭菌30min，接种简单诺卡氏菌斜面菌种，振荡培养，得到一级种子液；(3)二级种子培养：所述二级种子培养基包括按质量体积百分数(w/v)计的以下物质：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.25％、4-雄烯-3,17-二酮0.05％和泡敌0.02％；pH7.0-7.2，121℃灭菌30min，将所述一级种子液接种至所述二级种子培养基中，振荡培养，培养完成后得到简单诺卡氏菌菌液。进一步地，所述简单诺卡氏菌菌液中OD600值为0.5-2.0。进一步地，所述斜面培养的条件为：于25-40℃下，培养1-5d。进一步地，所述一级种子培养的条件为：于25-40℃下振荡培养，转速50-200rpm，培养时间10-72h。进一步地，所述二级种子培养的条件为：于25-40℃下振荡培养，转速50-200rpm，培养时间10-72h。进一步地，所述转化反应在10L发酵罐内进行时，条件为：空气流量0.05-0.6m3/h，罐压0.01-0.1MPa。进一步地，所述分离纯化方法具体为：将转化液升温到80℃并搅拌，保温静置分层，上层油相分出，冷却至常温，加3L甲醇，搅拌静置分层，上层甲醇减压浓缩，下层油层再继续萃取2次，上层甲醇层合并减压浓缩，浓缩温度50-70℃，浓缩至糊状，加水带干其中的甲醇，冷却至室温，抽滤，得类白色固体，固体70℃烘干；烘干后加入石油醚，升温60℃回流打浆，冷却至30℃以下，抽滤，滤饼用石油醚淋洗，抽干后烘干。进一步地，所述生物脱氢方法具体为：将简单诺卡氏菌经斜面培养、一级种子培养和二级种子培养制备成菌液，以菌液体积为6L计，在转化体系中加入4-雄烯-3,17-二酮120g、大豆油960g和吐温-806g；转化体系于30℃下进行转化反应72h，反应完全，反应物经分离纯化得到1,4-雄二烯-3,17-二酮。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术在采用普通直接转化法的基础上，通过加入大豆油和吐温-80，可以大幅度提高转化率，转化率可达到96％以上；同时产物的降解率低，反应专一性强，转化时间相对较快，产品质量高；并且无需无菌环境，常规室外操作即可，操作简单，适合工业化大批量生产。附图说明图1为雄烯二酮C1,2位脱氢的反应过程。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。以下实施例中所使用的物质均可自常规途径购买得到。4-雄烯-3,17-二酮以下简称4-AD，1,4-雄二烯-3,17-二酮以下简称ADD。实施例1简单诺卡氏菌种子培养菌种：简单诺卡氏菌斜面培养基：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.15％、酵母浸膏0.01-0.05％、琼脂粉0.01-2％；pH为7.0-7.2。培养条件：25-40℃，1-5d。一级种子培养基：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.15％、酵母浸膏0.01-0.05％；pH为7.0-7.2。培养条件：500ml摇瓶装100ml培养基，振荡培养，转速50-200rpm，25-40℃，培养时间10-72h。二级种子培养基：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.25％、4-雄烯-3,17-二酮0.05％和泡敌0.02％；pH为7.0-7.2。培养条件：500ml摇瓶装100ml培养基，振荡培养，转速50-200rpm，25-40℃，培养时间10-72h。培养得到的简单诺卡氏菌菌液中OD600值为0.5-2.0。实施例2摇瓶转化按照实施例1进行种子培养，将一级种子液接入二级种子培养基培养10h，向培养好的100ml二级种子中加入2g4-AD，转化72本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种雄烯二酮C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述方法为：以4-雄烯-3,17-二酮为底物，以简单诺卡氏菌菌液为酶源，同时将大豆油1％-16％(v/v)和吐温-80 0.05％-0.2％(w/v)加入转化体系中，于29-31℃下进行转化反应，反应完全，反应物经分离纯化得到1,4-雄二烯-3,17-二酮。/n

【技术特征摘要】
1.一种雄烯二酮C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述方法为：以4-雄烯-3,17-二酮为底物，以简单诺卡氏菌菌液为酶源，同时将大豆油1％-16％(v/v)和吐温-800.05％-0.2％(w/v)加入转化体系中，于29-31℃下进行转化反应，反应完全，反应物经分离纯化得到1,4-雄二烯-3,17-二酮。


2.根据权利要求1所述的一种雄烯二酮C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述底物的添加量按质量体积百分数(w/v)计为0.5％-10％。


3.根据权利要求1所述的一种雄烯二酮C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，所述简单诺卡氏菌菌液的制备方法为：
(1)斜面培养：所述斜面培养基包括按质量体积百分数(w/v)计的以下物质：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.15％、酵母浸膏0.01-0.05％和琼脂粉0.01-2％；pH7.0-7.2，121℃灭菌30min，接种简单诺卡氏菌菌种；
(2)一级种子培养：所述一级种子培养基包括按质量体积百分数(w/v)计的以下物质：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.15％和酵母浸膏0.01-0.05％；pH7.0-7.2，121℃灭菌30min，接种简单诺卡氏菌斜面菌种，振荡培养，得到一级种子液；
(3)二级种子培养：所述二级种子培养基包括按质量体积百分数(w/v)计的以下物质：葡萄糖0.1-1％、玉米浆0.1-1％、蛋白胨0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.25％、4-雄烯-3,17-二酮0.05％和泡敌0.02％；pH7.0-7.2，121℃灭菌30min，将所述一级种子液接种至所述二级种子培养基中，振荡培养，培养完成后得到简单诺卡氏菌菌液。


4.根据权利要求3所述的一种雄烯二酮C1,2位的生物脱氢方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟浩，刘喜荣，曾春玲，王敬华，赵小娟，
申请(专利权)人：湖南新合新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43