一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。该底盘细胞以大肠杆菌为出发菌株，敲除大肠杆菌基因组的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA；并且过表达碳存储调节因子csrB和乙酰辅酶A合成酶基因acs。同时，本发明专利技术还提供了该底盘细胞的制备方法及利用该底盘细胞生产乙酰辅酶A衍生产品的方法。本发明专利技术首次完成了乙酰辅酶A衍生类产品生物合成通用性底盘细胞的建立，实现了“一种改造一类生产”的目标，具有较大的创新性和应用潜力。本发明专利技术底盘细胞适用于生物合成乙酰辅酶A衍生类产品。

A general chassis cell for synthesis of derivatives of acetyl coenzyme A and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞及其构建方法与应用
本专利技术涉及一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞及其构建方法与应用，属于基因工程

技术介绍
乙酰辅酶A是细胞内的核心代谢物，对于维持细胞的正常生命活动至关重要。乙酰辅酶A作为前体可以合成多种类型的衍生产品，例如异戊二烯和萜类，聚酮类、聚羟基脂肪酸、脂类等，已广泛应用于医药、食品添加剂、化工、农业、化妆品等各大领域。目前国内外针对乙酰辅酶A衍生产品生物合成的研究较多，也取得许多重要的研究进展。例如间苯三酚(PG)是合成黄酮、异黄酮类药物的中间体，具有广泛的抗癌、抗心血管疾病的作用。通过过表达荧光假单胞菌聚酮合成酶基因phlD、大肠杆菌的乙酰CoA羧化酶基因accADBC，多重抗性激活因子marA，最终获得的菌株Q1944摇瓶水平间苯三酚浓度达到了0.51g/L。3-羟基丙酸(3HP)能够用于生产多种具有重要工业用途的化学品，还可作为合成新型可降解生物塑料的单体，在治理“白色污染”方面具有广阔的应用前景。通过对3HP合成途径关键酶丙二酸单酰辅酶A还原酶(malonyl-CoAreductase，MCR)进行功能域拆分、定向进化改造、酶催化平衡调控等多方面研究，最终获得的菌株Q2191摇瓶水平3-羟基丙酸的产量达到1.68g/L。尽管针对单一的乙酰辅酶A衍生产品的重组菌已有报道，然而，已报道的重组菌仅适用于特定的单一产品的生物合成，重组菌的改造过程繁琐、耗时、不具备通用性。而目前在大肠杆菌中暂无合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞的报道。因此，构建一种高效的乙酰辅酶A衍生产品通用性底盘细胞可以实现“一种改造一类生产”的目标，具有较大的创新性和应用潜力。
技术实现思路
为解决现有重组菌仅适用于特定的单一产品的生物合成，不具备通用性，如果对重组菌进行改造过程繁琐且耗时的问题，本专利技术提供了一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞及其构建方法和应用，采用的技术方案如下：本专利技术的目的在于提供一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞，该底盘细胞以大肠杆菌为出发菌株，敲除大肠杆菌基因组的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA；并且过表达碳存储调节因子csrB和乙酰辅酶A合成酶基因acs。本专利技术所述全局调控因子arcA的GeneID为948874；所述乙酸激酶基因ackA的GeneID为946775；所述碳存储调节因子csrB的GeneID为2847719；乙酰辅酶A合成酶基因acs的GeneID为948572。优选地，以大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)为出发菌株。本专利技术提供了一种上述任一所述的通用性底盘细胞的构建方法，包括如下步骤：1)分别敲除大肠杆菌E.coliBL21(DE3)基因组上的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA，获得突变菌株I；2)将强启动子的序列插入步骤1)所得突变菌株I的碳存储调节因子csrB基因序列前，获得突变菌株II；其中：强启动子为T7启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；3)将强启动子的序列插入步骤2)所得突变菌株II的乙酰辅酶A合成酶acs基因序列前，获得底盘细胞；其中：强启动子为T7启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。优选地，所述方法包括如下步骤：1)利用P1噬菌体转导法分别敲除出发菌株大肠杆菌BL21(DE3)基因组上的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA，获得突变菌株I，命名为E.coliBL21(DE3)△arcA△ackA；2)以如SEQIDNO.1-SEQIDNO.4所示的核苷酸序列为引物，以T7启动子的核苷酸序列为搭桥序列，克隆获得T7-csrB同源臂；将T7-csrB同源臂连接至自杀质粒pRE112，获得重组质粒pRE112-T7-csrB；利用重组质粒pRE112-T7-csrB介导的同源重组法在步骤1)所得的突变菌株I的碳存储调节因子csrB基因序列前插入T7启动子的核苷酸序列，获得突变菌株II，命名为E.coliBL21(DE3)△arcA△ackAT7-csrB；其中：T7启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；3)以如SEQIDNO.7-SEQIDNO.10所示的核苷酸序列为引物，以T7启动子的核苷酸序列为搭桥序列，克隆获得T7-acs同源臂；将T7-acs同源臂连接至自杀质粒pRE112，获得重组质粒pRE112-T7-acs；利用重组质粒pRE112-T7-acs介导的同源重组法在步骤2)所得的突变菌株II的乙酰辅酶A合成酶acs基因序列前插入T7启动子序列，获得底盘细胞，命名为E.coliBL21(DE3)△arcA△ackAT7-csrBT7-acs；其中：T7启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，具体为：TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCC。本专利技术还提供了上述的通用性底盘细胞在发酵生产乙酰辅酶A衍生产品中的应用。优选地，所述乙酰辅酶A衍生产品为间苯三酚或3-羟基丙酸。所述应用包括如下步骤：1)活化底盘细胞，将活化后的底盘细胞接种至无抗的LB培养基中，制备感受态细胞；2)将待生产的目标乙酰辅酶A衍生产品的重组质粒导入至步骤1)制备的感受态细胞中，获得待生产的乙酰辅酶A衍生产品的重组菌；3)将步骤2)所得重组菌接种到含抗生素的液体培养基中进行发酵培养。优选地，步骤3)是将步骤2)所得的重组菌按照1％(v/v)的接种量接种到培养基中，然后在37℃、180rpm的条件下培养至OD600达到0.6时，加入100μM异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导，诱导后置于30℃，180rpm的条件下继续培养至发酵结束。优选地，步骤2)所述乙酰辅酶A衍生产品为间苯三酚或3-羟基丙酸。本专利技术还提供了一种利用上述所述的通用性底盘细胞发酵生产间苯三酚的方法，包括如下步骤：1)活化底盘细胞，将活化后的底盘细胞接种至无抗的LB培养基中，制备感受态细胞；2)将重组质粒pET-phlD-mar和pA-accADBC导入至步骤1)制备的感受态细胞中，获得生产间苯三酚的重组菌；3)将步骤2)所得生产间苯三酚的重组菌接种到含抗生素的液体培养基中进行发酵培养。本专利技术还提供了一种利用上述通用性底盘细胞发酵生产3-羟基丙酸的方法，包括如下步骤：1)活化底盘细胞，将活化后的底盘细胞接种至无抗的LB培养基中，制备感受态细胞；2)将重组质粒pMCR-N-C-N940V/K1106W/S1114R和pA-accADBC导入至步骤1)制备的感受态细胞中，获得生产3-羟基丙酸的重组菌；3)将步骤2)所得生产3-羟基丙酸的重组菌接种到含抗生素的液体培养基中进行发酵培养。本专利技术中制备感受态细胞的方法可以采用氯化钙法。本专利技术中重组质粒导入感受态可以采用热激转化法。本专利技术所述的P1噬菌体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，敲除大肠杆菌基因组的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA；并且过表达碳存储调节因子csrB和乙酰辅酶A合成酶基因acs。/n

【技术特征摘要】
1.一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，敲除大肠杆菌基因组的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA；并且过表达碳存储调节因子csrB和乙酰辅酶A合成酶基因acs。


2.根据权利要求1所述的通用性底盘细胞，其特征在于，以大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)为出发菌株。


3.一种权利要求1或2所述的通用性底盘细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)分别敲除大肠杆菌E.coliBL21(DE3)基因组上的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA，获得突变菌株I；
2)将强启动子的序列插入步骤1)所得突变菌株I的碳存储调节因子csrB基因序列前，获得突变菌株II；其中：强启动子为T7启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；
3)将强启动子的序列插入步骤2)所得突变菌株II的乙酰辅酶A合成酶acs基因序列前，获得底盘细胞；其中：强启动子为T7启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。


4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)利用P1噬菌体转导法分别敲除出发菌株大肠杆菌BL21(DE3)基因组上的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA，获得突变菌株I，命名为E.coliBL21(DE3)△arcA△ackA；
2)以如SEQIDNO.1-SEQIDNO.4所示的核苷酸序列为引物，以T7启动子的核苷酸序列为搭桥序列，克隆获得T7-csrB同源臂；将T7-csrB同源臂连接至自杀质粒pRE112，获得重组质粒pRE112-T7-csrB；利用重组质粒pRE112-T7-csrB介导的同源重组法在步骤1)所得的突变菌株I的碳存储调节因子csrB基因序列前插入T7启动子的核苷酸序列，获得突变菌株II，命名为E.coliBL21(DE3)△arcA△ackAT7-csrB；其中：T7启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；
3)以如SEQIDNO.7-SEQIDNO.10所示的核苷酸序列为引物，以T7启动子的核苷酸序列为搭桥序列，克隆获得T7-acs同源臂；将T7-acs同源臂连接至自杀质粒pRE112，获得重组质粒pRE112-T7-acs；利用重组质粒pRE112-T7-acs介...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵广，刘敏，咸漠，赵喆，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37