一种用于检测血清HPV抗体的试剂及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测血清HPV抗体的试剂，包含HPV6、11、16、18、31、33、45、52和58九种亚型的VLP，其中每种HVP亚型的VLP均由该亚型的L1蛋白和L2蛋白包装而成。还涉及一种包括上述试剂的试剂盒。

A reagent and kit for detection of serum HPV antibody

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测血清HPV抗体的试剂及试剂盒
本专利技术涉及HPV防治领域，更特别地，涉及一种用于检测血清HPV抗体的试剂及试剂盒。
技术介绍
宫颈癌是全球女性第二大癌症，仅次于乳腺癌。近年来，我国宫颈癌发病率持续走高，平均每年以8.7％的速度增长，其中农村地区增长率为10.3％，城市地区增长为5.6％；而死亡率则以8.1％的速度增长，防治形式不容乐观。宫颈癌的元凶是人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV)持续感染。根据HPV致病性的不同，将其分为低危型HPV和高危型HPV；低危型(HPV6、11型等)，可导致生殖器官的疣和良性肿瘤；高危型HPV(HPV16、18、31、33、45、52、58型等)会导致女性宫颈癌、男性阴茎癌。其中，约54％的宫颈癌是HPV16感染引起的，约16％的宫颈癌是HPV18感染引起的，因此控制高危型HPV病毒的持续感染对宫颈癌的防治有非常大的意义，目前主要的防控方式是通过大力推广HPV筛查和接种HPV疫苗。目前市场上已有的HPV疫苗是葛兰素史克(GSK)公司针对HPV16和HPV18的希瑞适双价疫苗和默沙东公司的针对HPV16,HPV18,HPV11和HPV6的佳达修四价疫苗以及针对HPV(6、11、16、18、31、33、45、52、58型)的佳达修九价疫苗。这些疫苗是利用不同表达系统来生产HPVL1蛋白的病毒样颗粒(Virallikeparticle，VLP)，通过接种HPVVLP从而在机体内产生高效的保护性抗体来抑制病毒感染。因此是否产生了高效的保护性抗体是衡量HPV疫苗接种成功的重要指标。研究表明，不同亚型的HPVVLP诱导的抗体主要抑制自身型别HPV病毒的感染，针对其它型别HPV感染的交叉抑制效果不强。由于不同个体对疫苗的免疫反应是有差别的，产生相应保护抗体的水平也不同，多价疫苗中不同型VLP的抗原性也有差异，因此随着HPV疫苗的广泛接种，有必要检测HPV疫苗是否接种成功。研究表明当病毒样颗粒诱导的抗血清效价达到1000倍的血清稀释时，才会有针对HPV感染的很好的保护效果。另外最近爆发HPV假疫苗事件，以及存在HPV疫苗运输和保存过程中导致疫苗失效或者单人份HPV疫苗的接种剂量接种了多个受试者等原因导致HPV疫苗接种后未能产生高滴度的保护性抗体。鉴于此，评价HPV疫苗接种后是否产生了高滴度的保护性抗体显得十分必要。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种用于检测血清HPV抗体的试剂，其特征在于，包含HPV6、11、16、18、31、33、45、52和58九种亚型的VLP，其中每种HVP亚型的VLP均由该亚型的L1蛋白和L2蛋白包装而成。在一个优选实施方案中，所述九种亚型的VLP溶于pH8.5-10的CBS缓冲溶液中。在一个优选实施方案中，所述每种HVP亚型的VLP的浓度为60-150ng/mL。本专利技术还提供了一种用于检测血清HPV抗体的试剂盒，包括上述用于检测血清HPV抗体的试剂。在一个优选实施方案中，所述试剂盒为ELISA试剂盒，所述用于检测血清HPV抗体的试剂作为包被液。在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括封闭液。在一个优选实施方案中，所述封闭液为含有3-10g/100mL的脱脂奶粉的PBST溶液。在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括人二抗，所述人二抗具有可识别的标志物。附图说明图1为HPV疫苗接种者针对HPVVLP效价测定。PV4001,PV4002和PV4003为接种HPV4价疫苗的受试者血清，PV9004为接种HPV9价疫苗受试者血清，H001,002,003为未接种HPV疫苗受试者血清，作为阴性对照。图2HPV疫苗接种者针对不同亚型HPVVLP效价测定。PV4001,PV4002和PV4003为接种HPV4价疫苗的受试者血清，PV9004为接种HPV9价疫苗受试者血清，H001,002,003为未接种HPV疫苗受试者血清，作为阴性对照。1:500，1:1000，1:10000代表血清稀释倍数。具体实施方式1.制备HPVVLP从NCBI网站上获取HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58九个亚型HPV病毒的L1,L2序列，将序列克隆到pCDNA3.1。以CMV为启动子，L1和L2两个ORF框之间通过IRES连接。将构建正确的克隆，摇菌，无内毒素质粒大提备用。将上述构建好的质粒转染293T细胞，44-52h后，裂解细胞，加入pH9.0的硫酸铵溶液涡旋后，放入37℃温箱中成熟过夜，通过盐粗提赫超速离心纯化获得高纯度的不同亚型的HPVVLP蛋白。2.HPV抗体检测剂将以上9种VLP等比例混合，然后按照总浓度900ng/ml将9种亚型的VLP等比例混合，随后按照总浓度900ng/ml稀释到CBS包被液中、100ul/孔，即每种VLP10ng/孔包被在ELISA板条中，4℃孵育过夜。次日，以洗涤缓冲液PBST洗涤3遍，250ulPBST/孔，甩干孔中洗涤液并于无尘吸水纸上拍干。封闭：配制含有5％牛血清的PBST作为封闭液，加封闭液于酶标板中，250ul/孔，置于37℃2小时，封闭完毕洗涤3遍。上样：将疫苗接种者血清样品及健康志愿者血清样品以1:900开始，作3倍稀释在封闭液中，共11个梯度，每个梯度100ul/孔上样，37℃1.5小时，上样完毕洗涤3遍。二抗：将羊抗人-HRP二抗以1：5000稀释在封闭液中，100ul/孔加入酶标板中，置于4℃45min，二抗孵育完毕洗涤4遍。显色：将显色底物液TMBA液和B液按照1:1混匀，100ul/孔加入酶标板中，37℃10min。终止：向显色完毕的孔中加终止液1MH2SO4，50ul/孔。读数：于酶标仪上波长450nm处读取OD值，并保存数据。结果如图1所示：四位HPV疫苗接种者(PV4001,PV4002,PV4003和PV9004)血清里，PV4003和PV9004产生了高滴度针对HPVVLP的抗血清，PV4003的血清效价为729,000倍稀释，PV9004的血清效价为243,000倍稀释。而其他的疫苗接种者以未接种疫苗的受试者(H001,H002和H003)体内均未观察到高滴度针对HPVVLP的抗血清。以上结果提示，部分HPV疫苗接种者体内产生了高滴度针对HPVVLP的抗血清，然而部分受试者接种疫苗后并未成功得产生针对HPVVLP的高滴度抗体。由于不同亚型的VLP蛋白诱导产生的抗体大多只抑制自身型别的HPV感染，另外HPV16和HPV18会诱发80％的宫颈癌，因此检测接种疫苗后是否产生了针对不同型别的高滴度的抗体，尤其是针对HPV16和HPV18高滴度的抗体显得十分必要。包被：将不同亚型的VLP以100ng/ml稀释到CBS包被液中，100ul/孔，即10ng/孔加入ELISA板条中，4℃孵育过夜。封闭同前。上样：将疫苗接种者血清样品及健康志愿者血清样品以1:500，1:1000，1:5000开始三个稀释在封闭液中，100ul/孔本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测血清HPV抗体的试剂，其特征在于，包含HPV6、11、16、18、31、33、45、52和58九种亚型的VLP，其中每种HVP亚型的VLP均由该亚型的L1蛋白和L2蛋白包装而成。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测血清HPV抗体的试剂，其特征在于，包含HPV6、11、16、18、31、33、45、52和58九种亚型的VLP，其中每种HVP亚型的VLP均由该亚型的L1蛋白和L2蛋白包装而成。


2.根据权利要求1所述的用于检测血清HPV抗体的试剂，其特征在于，所述九种亚型的VLP溶于pH8.5-10的CBS缓冲溶液中。


3.根据权利要求2所述的用于检测血清HPV抗体的试剂，其特征在于，所述每种HVP亚型的VLP的浓度为60-150ng/mL。


4.一种用于检测血清HPV抗体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴稚伟，吴喜林，袁换云，马晓花，李彦磊，
申请(专利权)人：源道隆苏州医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32