一种转基因玉米DAS-40278-9的RPA引物与探针组合、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因玉米DAS‑40278‑9的RPA引物与探针组合、试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。采用所述RPA引物及探针组合检测转基因玉米DAS‑40278‑9的具体方法为：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的RPA引物和探针组合进行快速扩增及实时荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则表明样本中含有转基因玉米DAS‑40278‑9。本发明专利技术所提供的转基因玉米DAS‑40278‑9的RPA引物及探针组合扩增效果好，条带特异性强、灵敏度高，为转基因玉米DAS‑40278‑9及其衍生品种的检测提供了新的技术手段。

RPA primer and probe combination, kit and detection method of transgenic maize das-40278-9

【技术实现步骤摘要】
一种转基因玉米DAS-40278-9的RPA引物与探针组合、试剂盒及检测方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种转基因玉米DAS-40278-9的RPA(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)引物与探针组合、试剂盒及检测方法。
技术介绍
转基因作物作为目前世界上最重要的转基因产品之一，已经带来了巨大社会和经济效益。转基因作物2017年全球市场价值达到了158亿美元，其中玉米是获批转化体最多的作物(29个国家和地区，218个转化体)。然而，转基因玉米对人和动物健康的风险和对生态环境与农业的风险不容忽视。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价，标识和进口安全管理三个配套管理办法。转基因抗除草剂玉米DAS-40278-9品系由美国陶氏益农公司研发，其经过遗传改良后表达一种芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)的蛋白质，该AAD-1蛋白带有α酶酮戊二酸依赖性双加氧酶的活性而降解包括2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和芳氧苯氧丙酸酯类(FOP)家族除草剂，从而产生2，4-D和FOP家族除草剂耐受性。转基因抗除草剂玉米DAS-40278-9已经获得欧盟、美国、澳大利亚、巴西、加拿大、哥伦比亚、新西兰、韩国等国家的批准。我国在2017年6月批准了该转基因玉米。对转基因产品作出综合评价，除了需要各国政府和国际机构制定科学的安全评价体系以及严格的管理法规外，能够建立有效的转基因玉米便捷、快速检测方法是对转基因作物进行安全性评价和实施监管的基础，也是农产品国际贸易健康发展的重要保障。转基因产品的检测需要快速、准确、灵敏，并且还要满足样品量大，目标基因种类多等特点。因此，目前转基因作物的检测方法一般是检测样品中是否含有外源基因。目前主要是PCR检测方法，包括普通PCR方法、实时荧光PCR检测方法。这两种方法都需要变温过程及其相应的快速升降温及温度控制，也就需要价格高昂的专用PCR设备。并且PCR方法反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；PCR方法扩增时间2-3小时，扩增结果的电泳时间需要1小时左右；电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性，且难以实行现场检测。所以，在生产实践和口岸一线检测中PCR检测方法，包括普通PCR方法、实时荧光PCR检测方法。所以，在生产实践和口岸一线检测中需要一种快速、简便、易普及、安全可靠且适合于现场操作的转基因作物检测方法。环介导等温扩增法尽管可以在恒温条件下进行扩增并有简易的可视化结果判定方法，但是要准确的读取结果还需要借助核酸电泳分析设备，并且操作时间较长，极容易出现非特异性扩增。重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)是一种多种酶和蛋白参与，在恒定温度条件下实现核酸指数扩增的新技术，取代了模拟体内DNA复制和修复时双链模板的完全解离和引物退火时的温度循环模式，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。该方法不需要复杂的仪器设备，特别适用于现场快速检测。目前尚未有将RPA法应用于快速检测转基因玉米DAS-40278-9及其衍生品种的试剂盒。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种转基因玉米DAS-40278-9的RPA检测引物和探针组合，用于检测转基因玉米DAS-40278-9及其衍生品种。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供一种转基因玉米DAS-40278-9检测试剂盒。本专利技术所要解决的最后一个技术问题是提供转基因玉米DAS-40278-9的RPA检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种转基因玉米DAS-40278-9的RPA引物与探针组合，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示。所述的引物和探针组合在检测转基因玉米DAS-40278-9或其衍生品种中的应用。所述的引物和探针组合在制备转基因玉米DAS-40278-9或其衍生品种的检测试剂或检测试剂盒中的应用。一种转基因玉米DAS-40278-9的检测试剂盒，至少包括1次用量以上的权利要求1所述的RPA引物和探针组合，所述RPA引物和探针组合，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示。所述转基因玉米DAS-40278-9的检测试剂盒在检测转基因玉米DAS-40278-9或其衍生品种中的应用。一种检测转基因玉米DAS-40278-9的方法：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物对及探针组合，或权利要求4所述转基因玉米DAS-40278-9的检测试剂盒进行快速扩增及实时荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则表明所检样品含有转基因玉米DAS-40278-9。优选地，所述检测转基因玉米DAS-40278-9的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)采用CTAB法提取样品DNA；2)在200μLPCR管配制50μL的反应体系：引物DAS-9-F62.1μL、DAS-9-R62.1μL、DAS-P21μL、2×reactionbuffer23.6μL、dNTP8.2μL、10×ProbeE-mix5μL、20×CorereactionMix2.5μL、50×Exo1μL、280mMMgOAc2.5μL、DNA2μL；3)将PCR管置于荧光检测仪中，37～42℃孵育30min，如果得到明显的扩增曲线，则表明所检样品含有转基因玉米DAS-40278-9。优选地，所述的DAS-9-F6、DAS-9-R6和DAS-P2均为0.21μM。优选地，所述的DNA浓度不小于0.05％。有益效果：相比于现有技术，本专利技术的优点为：(1)快速高效：整个扩增只用20～30min即可完成；(2)操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定扩增荧光检测仪就能反应和检测，条件简单温和；(3)高特异性：本专利技术根据转基因玉米DAS-40278-9的外源基因与内源基因结合处设计了两条特异性引物，一条探针，扩增靶序列的一个区域，具有很强的品系特异性，且非常稳定；(4)高灵敏度：最低检测极限可达到0.05％，比普通PCR灵敏度高100倍；(5)鉴定简便：可通过观察荧光信号的有无来判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合基层实验室检测。附图说明图1为RPA探针DAS-9-P2的特异性检测结果图；从上到下：转基因玉米DAS-40278-9、转基因玉米MON88017、转基因玉米MIR162、转基因玉米MON863、转基因玉米转基因玉米NK603、转基因玉米GA21、阴性对照；图2为RPA探针DAS-9-P2的特异性检测结果图；从上到下：转基因玉米DAS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因玉米DAS-40278-9的RPA引物与探针组合，其特征在于：其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种转基因玉米DAS-40278-9的RPA引物与探针组合，其特征在于：其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示。


2.权利要求1所述的引物与探针组合在检测转基因玉米DAS-40278-9或其衍生品种中的应用。


3.权利要求1所述的引物与探针组合在制备转基因玉米DAS-40278-9或其衍生品种的检测试剂或检测试剂盒中的应用。


4.一种转基因玉米DAS-40278-9的检测试剂盒，其特征在于，至少包括1次用量以上的权利要求1所述的RPA引物和探针组合，所述RPA引物和探针组合，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示。


5.权利要求4所述转基因玉米DAS-40278-9的检测试剂盒在检测转基因玉米DAS-40278-9或其衍生品种中的应用。


6.一种检测转基因玉米DAS-40278-9的方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物对及探针组合，或权利要求4所述转基因玉米DAS-402...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦彬彬，何善勇，戴婷婷，徐飞，俞禄珍，李想，
申请(专利权)人：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：上海;31