一种真菌来源β螺旋桨型重组植酸酶r-AoPhytase及其表达菌株和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种真菌来源β螺旋桨型重组植酸酶r‑AoPhytase及其表达菌株和应用，所述β螺旋桨型重组植酸酶r‑AoPhytase的原始来源为捕食线虫性真菌Arthrobotry oligosopra，其氨基酸序列为如下氨基酸序列中的一种：(1)序列表中的SEQ ID No：1；(2)序列表中的SEQ ID No：1经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；(3)与序列表中的SEQ ID No：1具有80％以上同源性的突变氨基酸序列。本发明专利技术重组植酸酶r‑AoPhytase具有较高的比酶活，接近中性的最适pH和较高的最适温度，具有促进不同饲料样品中无机磷、可溶性矿物质的释放能力，适用于饲料加工与生产中。

A fungal source of \u03b2 - propeller type recombinant phytase r-aophase and its expression strain and Application

【技术实现步骤摘要】
一种真菌来源β螺旋桨型重组植酸酶r-AoPhytase及其表达菌株和应用
本专利技术属于分子生物学和基因工程领域，具体涉及一种真菌来源β螺旋桨型重组植酸酶r-AoPhytase及其表达菌株和应用。
技术介绍
植酸酶制剂在动物和人类营养品中有广泛的应用。它可水解植酸盐(肌醇-1，2，3，4，5，6-六磷酸盐)，生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸(Mullaney,Daly,&Ullah,2000)。植酸盐被认为是植物中磷酸盐和肌醇的主要储存形式，植酸衍生物占植物源饲料中磷的60-80％。同时植酸也是一种聚阴离子螯合剂，它可与几种主要的有营养价值的二价阳离子，如Ca2+，Mg2+，Zn2+，Cu2+，Fe2+和Mn2+形成复合物(Chen&Headquarters,2000)。植酸酶被广泛应用于商业化的家禽、猪和鱼类饲料中，以提高磷、矿物质、氨基酸等的利用率。肌醇六磷酸盐分子以及与其结合的营养物质不会被消化道吸收，但可以被植酸酶酶促降解，促进其吸收。在饲料中添加植酸酶也可以明显提高矿质元素钙、镁及微量元素锌、铜、铁、锰等的利用率(Lonnerdal,2000)。除此以外，在饲料中添加植酸酶还能够提高动物对蛋白质和氨基酸的消化吸收，这是因为植酸酶在水解植酸释放磷的同时，可以将与植酸络合的蛋白质释放出来，便于消化道分泌的各种蛋白酶作用；同时还可以释放与植酸结合的内源性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，从而提高消化利用率。植酸酶也可以用于食品的加工过程，在食品中添加植酸酶既可以提高磷及其他矿质元素的利用率，也可以提高蛋白质、淀粉和脂肪等营养物质的利用率(Haefneretal.,2005)。植酸酶广泛存在于动植物中，如水稻、小麦、玉米(Ullah&Gibson,1988)、大豆等一些植物种子中均含有植酸酶，哺乳动物的小肠及脊椎动物的红细胞中含有植酸酶，但含量很少且活性很低。在牛等反刍动物的瘤胃中植酸酶的活性较高。也存在于微生物(细菌、真菌和酵母)中，如霉菌中的曲霉属就存在植酸酶。目前研究最多的是通过微生物生产植酸酶，蛋白分离纯化和理化性质分析结果表明，它们是植酸酶工业化的最佳来源(Lei,Porres,Mullaney,&Brinch-Pedersen,2007)。BPP型植酸酶是最近发现的一类全新的碱性磷酸酶酶，是在自然界中最丰富的和结构多样性最广的一类植酸酶。迄今为止，所有的已知的BPP型植酸酶均来源于细菌，特别是芽孢杆菌(Singh&Satyanarayana,2015)。例如，从枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中分别分离出的植酸酶phyC和TS-Phy就属于BPPs(Haetal.,2000)。目前细菌来源的BPP型植酸酶的比酶活偏低，且最适pH和最适温度不适宜于饲料加工工艺的应用。针对这一技术需求，本专利技术开发了一种来源于真菌的BPP型植酸酶。我们首次以捕食线虫性真菌Arthrobotryoligosopra为出发材料，研发了真菌来源的β螺旋桨型植酸酶Aophytase及其重组制备方法，发现该真菌来源的BPP型重组植酸酶具有较高的比酶活性，接近中性的最适pH和较高的最适温度，其具有促进不同饲料样品中无机磷、可溶性矿物质的释放能力，适用于饲料加工与生产中的应用。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术的不足，提供了一种真菌来源β螺旋桨型重组植酸酶r-AoPhytase及其表达菌株和应用。本专利技术重组植酸酶r-AoPhytase具有较高的比酶活，接近中性的最适pH和较高的最适温度，具有促进不同饲料样品中无机磷、可溶性矿物质的释放能力，适用于饲料加工与生产中的应用。本专利技术真菌来源β螺旋桨型重组植酸酶r-AoPhytase，其原始来源是捕食线虫性真菌Arthrobotryoligosopra，由782aa氨基酸组成，分子量为84.2KDa，等电点为5.58，其氨基酸序列为如下氨基酸序列中的一种：(1)序列表中的SEQIDNo：1；(2)序列表中的SEQIDNo：1经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；(3)与序列表中的SEQIDNo：1具有80％以上同源性的突变氨基酸序列。编码所述β螺旋桨型重组植酸酶的编码基因，为具有如下核苷酸序列中的一种：(1)序列表中的SEQIDNo：2或SEQIDNo：3；(2)序列表中的SEQIDNo：2或SEQIDNo：3经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸残基且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(3)编码序列表中SEQIDNo：1蛋白质序列的多核苷酸序列；(4)与序列表中的SEQIDNo：2或SEQIDNo：3具有80％以上同源性的突变核苷酸序列。本专利技术真菌来源β螺旋桨型重组植酸酶r-AoPhytase的重组表达菌株，其分类命名为：毕赤酵母GS115(5′PAOX1::pPICαZA-Aophytase)(PichiapastorisGS115(5′PAOX1::pPICαZA-Aophytase))，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2019年10月8日，保藏编号：CCTCCNO：M2019775。所述重组表达菌株的制备方法，首先通过化学合成所述r-AoPhytase基因，利用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切并与表达质粒载体连接，将连接产物转化感受态细胞，获得表达载体；然后通过SacⅠ酶使表达载体线性化，并将线性化的质粒电转化表达宿主细胞，利用引物P1和P2进行菌落PCR鉴定，获得可重组表达r-AoPhytase的重组工程菌株。所述引物P1的核苷酸序列如SEQIDNo：4所示，所述引物P2的核苷酸序列如SEQIDNo：5所示。所述表达质粒载体选自pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pPIC6αA、pPIC6αB、pPIC6αC、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pPIC9K或pPIC3.5K等。所述表达宿主选自PichiapastorisSMD1168(H)、SMD1165、SMD1163、GS115、X-33、MP-36、MC100-3或KM71(H)等。所述表达载体优选为pPICZαA-Aophytase，所述表达宿主细胞优选为毕赤酵母GS115。以所述重组表达菌株制备β螺旋桨型重组植酸酶r-AoPhytase的方法，包括如下步骤：步骤1：将所述重组表达菌株以1:1000接种至10mL-1LBMGY培养基中，220rpm摇床30℃培养约48h，测得OD600＝2-8；步骤2：将培养物以1500rpm离心10min，弃去上清，利用100mL-5LBMMY培养基，重悬沉淀，测得OD600＝0.4-4.0，220rpm摇床30℃诱导72h；步骤3：将上述培养液于4℃，8000rpm离心10min，收集上清，制备得粗酶液；步骤4：在上述粗酶液中加入5mLNiNTABeads6FF，4℃温孵2h，将温孵产物加入空本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真菌来源β螺旋桨型重组植酸酶r-AoPhytase，其特征在于：/n所述β螺旋桨型重组植酸酶r-AoPhytase的原始来源为捕食线虫性真菌Arthrobotryoligosopra，其氨基酸序列为如下氨基酸序列中的一种：/n(1)序列表中的SEQ ID No：1；/n(2)序列表中的SEQ ID No：1经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；/n(3)与序列表中的SEQ ID No：1具有80％以上同源性的突变氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种真菌来源β螺旋桨型重组植酸酶r-AoPhytase，其特征在于：
所述β螺旋桨型重组植酸酶r-AoPhytase的原始来源为捕食线虫性真菌Arthrobotryoligosopra，其氨基酸序列为如下氨基酸序列中的一种：
(1)序列表中的SEQIDNo：1；
(2)序列表中的SEQIDNo：1经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；
(3)与序列表中的SEQIDNo：1具有80％以上同源性的突变氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的真菌来源β螺旋桨型重组植酸酶r-AoPhytase，其特征在于：
所述真菌来源β螺旋桨型重组植酸酶r-AoPhytase由782aa氨基酸组成，分子量为84.2KDa，等电点为5.58。


3.编码权利要求1或2所述的β螺旋桨型重组植酸酶的编码基因，其特征在于为具有如下核苷酸序列中的一种：
(1)序列表中的SEQIDNo：2或SEQIDNo：3；
(2)序列表中的SEQIDNo：2或SEQIDNo：3经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸残基且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；
(3)编码序列表中SEQIDNo：1蛋白质序列的多核苷酸序列；
(4)与序列表中的SEQIDNo：2或SEQIDNo：3具有80％以上同源性的突变核苷酸序列。


4.一种权利要求1或2所述的β螺旋桨型重组植酸酶的重组表达菌株，其特征在于：
所述重组表达菌株的分类命名为：毕赤酵母GS115(5′PAOX1::pPICαZA-Aophytase)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2019年10月8日，保藏编号：CCTCCNO：M2019775。


5.权利要求4所述的重组表达菌株的制备方法，其特征在于：
首先通过化学合成所述r-AoPhytase基因，利用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切并与表达质粒载体连接，将连接产物转化感受态细胞，获得表达载体；然后通过SacⅠ酶使表达载体线性化，并将线性化的质粒电转化表达宿主细胞，利用引物P1和P2进行菌落PCR鉴定，获得可重组表达r-AoPhytase的重组工程菌株。


6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
所述引物P1的核苷酸序列如SEQIDNo：4所示，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永中，侯贤娟，沈振，孔小卫，盛康亮，汪静敏，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34