用于重组表达限制性内切酶的工程菌株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一类用于重组表达限制性内切酶的工程菌株及其构建方法，工程菌株为大肠杆菌ER2566，该工程菌株包含以下条件：兼容外源甲基转移酶；含有可保护四碱基通用序列的甲基转移酶基因的原核表达载体pACYC184；含有识别切割序列包含四碱基通用序列的限制性内切酶基因的原核表达载体pBAD；其中，四碱基通用序列包括：TCGA、TGCA、TTAA、AATT、ACGT、AGCT、CATG、CCGG、CGCG、CTAG、GATC、GCGC、GGCC、GTAC；与现有技术相比，本发明专利技术无需为每种限制酶筛选特定的甲基化保护菌株，大大减少了生产限制性内切酶所需的甲基转移酶保护菌株数量。

Engineering strain for recombinant expression of restriction endonuclease and its construction method

【技术实现步骤摘要】
用于重组表达限制性内切酶的工程菌株及其构建方法
本专利技术涉及生物化学及工程菌株，尤其涉及用于重组表达限制性内切酶的工程菌株及其构建方法。
技术介绍
限制性内切酶简称限制酶，是一大类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键，从而切断双链DNA的核酸内切酶，是最为重要的生物医学工具酶之一，被广泛应用于DNA重组、基因定位与克隆、基因结构研究、DNA序列分析与测定、基因合成等生物医学的各个领域。天然的限制酶主要来源于原核生物，与其对应的甲基转移酶组成了“限制-修饰”系统，“限制-修饰”主要用于对抗外源DNA分子进入，其生物学意义是保护宿主免受噬菌体感染，在原始宿主中，甲基转移酶会将宿主基因组及其自身细胞含有的质粒的特定序列进行甲基化，对应的限制酶就无法识别切割这些被甲基化的DNA，当外源DNA进入宿主时，由于其未被甲基化，故而会被限制酶切割成片段，从而失去功能。早期的限制酶大多从其原始菌种中分离出来，成本高，产量低，而且很多天然微生物不适合工业培养，无法用于限制酶提取分离，随后，科学家们将限制酶基因克隆出来，转入到工程菌株中进行重组表达以提高其产量。但由于限制酶具有能够切割未被甲基化保护的DNA的能力，在没有对应甲基转移酶保护的工程菌株中，限制酶具有很强的细胞毒性，导致重组表达难度极大。目前最有效的的限制性内切酶重组表达策略主要是利用特异性的“限制-修饰”系统：首先将与特定限制酶同源，识别并修饰同一DNA序列的专一性甲基转移酶基因转入到合适的大肠杆菌表达菌株中，表达出该甲基转移酶；然后筛选出宿主DNA的特定位点被甲基化修饰保护，无法被对应限制酶切割的保护菌株；最后将对应的限制酶基因转入该保护菌株中实现重组表达。由于每种限制酶都有其对应的甲基转移酶，如果采用上述策略重组表达目前已发现的3000多种限制酶，就需要筛选3000多种甲基转移酶保护菌株，工作量十分庞大，且效率低下；近来有研究者发现了一些广谱甲基转移酶，如来源于Spiroplasmasp.MQ1菌株的M.SssI，即能将识别序列5’-CG-3’中所有胞嘧啶残基甲基化，和来源于小球藻(Chlorella)病毒NYs-1的M.CviPI，即能将识别序列5’-GC-3’中所有胞嘧啶残基甲基化等；而目前已知有超过70种限制酶的识别序列包含CG，超过50种限制酶的识别序列包含GC。理论上如果将上述广谱甲基转移酶基因转入工程菌株，将DNA上的CG或GC序列甲基化，也可以抵抗限制酶的切割，从而用于重组表达限制酶，目前已有报道用该策略成功表达NotI、PstI等限制酶的案例。然而，CG或GC广谱甲基化在基因组上的甲基化位点过多，往往会给宿主带来过度的代谢负担，同样具有致死效应，因此使用该策略重组表达限制酶受到较大限制，因此本专利技术旨在利用修饰短同源序列的甲基转移酶，可以得到用于表达识别各种短同源序列限制酶的重组表达菌株，以用于经济和高效地生产限制性内切酶。
技术实现思路
本专利技术建立一种利用通用四碱基序列甲基转移酶筛选表达含有短同源序列的限制性内切酶，具体利用四碱基通用序列甲基化保护，用于表达限制性内切酶，大大提高其效率、降低成本，其具体方案如下：用于重组表达限制性内切酶的工程菌株，其特征在于：以大肠杆菌ER2566为工程菌株改造基础，，该工程菌株包含以下条件：(4)兼容外源甲基转移酶；(5)含有可保护四碱基通用序列的甲基转移酶基因的原核表达载体pACYC184；(6)含有识别切割序列包含四碱基通用序列的限制性内切酶基因的原核表达载体pBAD；其中，四碱基通用序列包括：TCGA、TGCA、TTAA、AATT、ACGT、AGCT、CATG、CCGG、CGCG、CTAG、GATC、GCGC、GGCC、GTAC。用于重组表达限制性内切酶的工程菌株的构建方法，其特征在于：所述构建方法具体包括如下步骤：S1：筛选工程菌株：确定以大肠杆菌ER2566为工程菌株改造基础，该工程菌株兼容外源甲基转移酶。，同时含有可保护四碱基通用序列的甲基转移酶基因的原核表达载体，以及含有识别切割序列包含四碱基通用序列的限制性内切酶基因的原核表达载体，其中，四碱基通用序列为TCGA、TGCA、TTAA、AATT、ACGT、AGCT、CATG、CCGG、CGCG、CTAG、GATC、GCGC、GGCC、GTAC。S2：选择表达质粒：选择带有Amp启动子的pACYC184质粒作为甲基转移酶表达质粒，使用抗性为氯霉素，选择带有阿拉伯糖操纵子与启动子的pBAD质粒作为限制性内切酶表达质粒，使用抗性为氨苄青霉素；S3：中间菌株获取：根据S1中四碱基通用序列组合和甲基化模式，选择特定的甲基转移酶基因，选择的特定甲基转移酶基因与S2中pACYC184相连接得到重组质粒，重组质粒转化至大肠杆菌ER2566菌株获取中间菌株；S4：筛选菌株：根据S3选择的甲基转移酶的甲基化序列及甲基化位点方式，选择识别序列包含该四碱基通用序列且甲基化敏感性与甲基转移酶作用点相同的限制性内切酶，切割步骤S3中获取的中间菌株DNA，筛选出无法被切割的甲基化保护菌株，S5：表达菌株构建：将S4中限制性内切酶对应基因与S2中pBAD相连接得到重组质粒，将重组质粒转化S4筛选菌株中，即得到可表达相应限制性内切酶的工程菌株；S6：工程菌株的表达：利用步骤S5获得的限制性内切酶的工程菌株，诱导表达限制性内-切酶。进一步的，所述四碱基通用序列的甲基转移酶包括：(1)TCGA：M.TaqI；(2)TGCA：M.HpyCH4V；(3)TTAA：M.EsaDix5I，M.MseI；(4)AATT：M.MluCI；(5)ACGT：M.HpyCH4IV，M.TaiI；(6)AGCT：M.CvikI-1，AluI；(7)CATG：M.FaeI，M.CviAII，M.NlaIII；(8)CCGG：M.MspI，M.HpaII；(9)CGCG：M.BstuI；(10)CTAG：M.BfaI；(11)GATC：M.Sau3AI，M.BstKTI，M.DpnII，M.BfuCI，M.MboI；(12)GCGC：M.HinPII，M.HhaI；(13)GGCC：M.HaeIII，M.CvikI-1，M.PhoI；(14)GTAC：M.Csp6I，M.CviQI，M.RsaI；所述识别切割序列包含四碱基通用序列的限制性内切酶包括：(1)TCGA：AccI，BstBI，SalI，XhoII，TliI，PaeR7I，BspDI，ClaI；(2)TGCA：ApaII，PstI，SfcI，NsiI；(3)TTAA：AseI，HincII，HpaI，SmII，AflII；(4)AATT：ApoI，EcoRI，MfeI；(5)ACGT：SnaBI，AatII，ZraI，BsaHI，BsaAI，PmII，AcII；(6)AGCT：SacI，Eco53kI，Ecll36II，MspAII，PvuII，HindIII；(7)CATG：SphI，BsaJI，BtgI，StyI，NspI，AffIII，PciI；(8)CCGG：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于重组表达限制性内切酶的工程菌株，其特征在于：以大肠杆菌ER2566为工程菌株改造基础，该工程菌株包含以下条件：/n(1)兼容外源甲基转移酶；/n(2)含有可保护四碱基通用序列的甲基转移酶基因的原核表达载体pACYC184；/n(3)含有识别切割序列包含四碱基通用序列的限制性内切酶基因的原核表达载体pBAD；其中，四碱基通用序列包括：TCGA、TGCA、TTAA、AATT、ACGT、AGCT、CATG、CCGG、CGCG、CTAG、GATC、GCGC、GGCC、GTAC。/n

【技术特征摘要】
1.用于重组表达限制性内切酶的工程菌株，其特征在于：以大肠杆菌ER2566为工程菌株改造基础，该工程菌株包含以下条件：
(1)兼容外源甲基转移酶；
(2)含有可保护四碱基通用序列的甲基转移酶基因的原核表达载体pACYC184；
(3)含有识别切割序列包含四碱基通用序列的限制性内切酶基因的原核表达载体pBAD；其中，四碱基通用序列包括：TCGA、TGCA、TTAA、AATT、ACGT、AGCT、CATG、CCGG、CGCG、CTAG、GATC、GCGC、GGCC、GTAC。


2.如权利要求1所述的用于重组表达限制性内切酶的工程菌株的构建方法，其特征在于：所述构建方法具体包括如下步骤：
S1：筛选工程菌株：确定以大肠杆菌ER2566为工程菌株改造基础，该工程菌株兼容外源甲基转移酶，同时含有可保护四碱基通用序列的甲基转移酶基因的原核表达载体，以及含有识别切割序列包含四碱基通用序列的限制性内切酶基因的原核表达载体，其中，四碱基通用序列为TCGA、TGCA、TTAA、AATT、ACGT、AGCT、CATG、CCGG、CGCG、CTAG、GATC、GCGC、GGCC、GTAC。
S2：选择表达质粒：选择带有Amp启动子的pACYC184质粒作为甲基转移酶表达质粒，使用抗性为氯霉素，选择带有阿拉伯糖操纵子与启动子的pBAD质粒作为限制性内切酶表达质粒，使用抗性为氨苄青霉素；
S3：中间菌株获取：根据S1中四碱基通用序列组合和甲基化模式，选择特定的甲基转移酶基因，选择的特定甲基转移酶基因与S2中pACYC184相连接得到重组质粒，重组质粒转化至大肠杆菌ER2566菌株获取中间菌株；
S4：筛选菌株：根据S3选择的甲基转移酶的甲基化序列及甲基化位点方式，选择识别序列包含该四碱基通用序列且甲基化敏感性与甲基转移酶作用点相同的限制性内切酶，切割步骤S3中获取的中间菌株DNA，筛选出无法被切割的甲基化保护菌株，
S5：表达菌株构建：将S4中限制性内切酶对应基因与S2中pBAD相连接得到重组质粒，将重组质粒转化S4筛选菌株中，即得到可表达相应限制性内切酶的工程菌株；
S6：工程菌株的表达：利用步骤S5获得的限制性内切酶的工程菌株，诱导表达限制性内切酶。


3.根据权利要求1或2所述的用于重组表达限制性内切酶工程菌株，其特征在于：所述四碱基通用序列的甲基转移酶包括：(1)TCGA：M.TaqI；(2)TGCA：M.HpyCH4V；(3)TTAA：M.EsaDix5I，M.MseI；(4)AATT：M.MluCI；(5)ACGT：M.HpyCH4IV，M.TaiI；(6)AGCT：M.CvikI-1，M.AluI；(7)CATG：M.FaeI，M.CviAII，M.NlaIII；(8)CCGG：M.MspI，M.HpaII；(9)CGCG：M.BstuI；(10)CTAG：M.BfaI；(11)GATC：M.Sau3AI，M.BstKTI，M.DpnII，M.BfuCI，M.MboI；(12)GCGC：M.HinPII，M.HhaI；(13)GGCC：M.HaeIII，M.CvikI-1，M.PhoI；(14)GTAC：M.Csp6I，M.CviQI，M.RsaI；所述识别切割序列包含四碱基通用序列的限制性内切酶包括：(1)TCGA：AccI，BstBI，SalI，XhoII，TliI，PaeR7I，BspDI，ClaI；(2)TGCA：ApaII，PstI，SfcI，NsiI；(3)TTAA：AseI，HincII，HpaI，SmII，AflII；(4)AATT：ApoI，EcoRI，MfeI；(5)ACGT：SnaBI，AatII，ZraI，BsaHI，BsaAI，PmII，AcII；(6)AGCT：SacI，Eco53kI，Ecll36II，MspAII，PvuII，HindIII；(7)CATG：SphI，BsaJI，BtgI，StyI，NspI，AffIII，PciI；(8)CCGG：SmaI，AvaI，AcoI，XmaI，TspMI，BsaWI，BsrFI，AgeI；(9)CGCG：NruI，BssHII，SacII，AflIII，MluI；(10)CTAG：XbaI，BmtI，NheI，AvrII，SpeI；(11)GATC：NlaIV，BstYI，BsiEI，BclI，BmaHI，PvuI，B...

【专利技术属性】
技术研发人员：张坤晓，许恒皓，韩挺翰，龚雪梅，张惠铭，胡艳红，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32