基于核酸适配体检测沙门氏菌的生物传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测沙门氏菌的生物传感器，基于核酸适配体与目标物的特异性识别，将发夹探针HAP打开，利用支点介导的链置换反应，将S1从复合探针S上置换下来，置换下来的S可以通过催化发夹自组装（CHA）放大方式使得形成G‑四联体的序列暴露出来，在存在血红素时形成G‑四联体/血红素DNA酶。运用G‑四联体/血红素类辣根过氧化物酶的催化性能来将半胱氨酸氧化成胱氨酸，无法实现半胱氨酸与银簇之间的通过金硫键的电荷转移，从而调控荧光信号传导，从而构建了适体生物传感器，该传感器反应只需要一步，因此具有检测速度快，操作简便，价格低廉，检测限低，特异性高等优点。

Biosensor for detection of Salmonella based on nucleic acid fitness and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
基于核酸适配体检测沙门氏菌的生物传感器及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物传感器
，特别涉及基于核酸适配体检测沙门氏菌的生物传感器，还涉及其制备方法。
技术介绍
沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，是革兰氏阴性、细胞内寄生的一种肠道菌。该菌广泛存在于自然界中，不但能引起家畜家禽及其他动物发生急性、慢性或隐性感染，而且还能通过污染食物导致人的食物中毒，对人类造成很大威胁。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙门氏菌每年导致70万人死亡。如果不采取行动制止这一全球性威胁，预计到2050年全球将有1000万人死亡。在我国沙门氏菌是食物中毒中最常见的致病菌，占食物中毒的第一位。目前报道的检测沙门氏菌的方法包括传统的培养方法、酶联免疫法、PCR技术等。这些传统的沙门氏菌检测方法检测周期长，工序繁琐，设备昂贵，远远不能满足要求。因此，急需一种快速、准确、简便、微量的分析方法，以对食品中的沙门氏菌进行检测。近几年，DNA生物传感检测技术凭借其高灵敏性和特异性得到广泛的关注。其中荧光技术具有灵敏度高、特异性强、价格低廉、无需样品预处理等显著的优势，在生物学、医学等领域中越来越受到人们的重视。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中检测沙门氏菌的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高、检测周期长的问题，本专利技术提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于无酶荧光信号传导的检测沙门氏菌的生物传感器。本专利技术的另一目的是提供一种上述生物传感器在检测沙门氏菌中的应用与方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种检测沙门氏菌的生物传感器，包括发夹探针HAP、复合探针S、核酸链S2、核酸链C、发卡探针H1、发卡探针H2、发卡探针H3、半胱氨酸、血红素、沙门氏菌和缓冲液；所述的HAP碱基系列如SEQNo.1所示；所述的S0碱基系列如SEQNo.2所示；所述的S1碱基系列如SEQNo.3所示；所述的S2碱基系列如SEQNo.4所示；所述的H1碱基系列如SEQNo.5所示；所述的H2碱基系列如SEQNo.6所示；所述的H3碱基系列如SEQNo.7所示；所述的C碱基系列如SEQNo.8所示。本专利技术中沙门氏菌的检测是在均相溶液中实现的，通过无酶辅助的等温放大方式来实现信号的放大，从而实现沙门氏菌的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。在均相反应中，反应条件为37℃，反应时间是90min。所述的检测沙门氏菌的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）复合探针S的构建；（2）DNA银纳米簇的合成（AgNCs-DNA）；（3）均相反应：将沙门氏菌与发夹探针HAP加入到均相中，同时加入复合探针S、核酸链S2、H1、H2、H3、AgNCs-DNA半胱氨酸、血红素、缓冲液，混和均匀后孵育；（4）荧光仪检测荧光强度。所述的步骤（1）复合探针S的构建步骤如下：将灭菌水、10×PB、S0探针和S1探针加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20℃备用。所述的步骤（2）DNA银纳米簇的合成（AgNCs-DNA）操作步骤如下：将15μL的100μM核酸链C和73μL的20mMPB（pH7.0）缓冲液加入到用锡箔纸包裹的EP管中，然后再加入6μL的1.5mM的AgNO3溶液（确保Ag+与H3的比例为6:1），震荡1min，于4℃下放置30min；30min后，继续向EP管中加入6μL的1.5mM的NaBH4，震荡1min，于4℃下黑暗放置6h以上即得。所述的步骤（3）均相反应操作步骤如下：将3μL沙门氏菌（5.0×105cfu/mL）、发夹探针HAP（1.5μL，500nM）、复合探针S（3μL，1μM）、核酸链S2（3μL，1μM）、H1（3μL，1μM）、H2（3μL，1μM）、H3（3μL，1μM）、AgNCs-DNA（14μL，4μM）、半胱氨酸1μM、血红素（3μL，1μM）、缓冲液加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴90min。所述的步骤（4）荧光仪设置激发波长为570nm。所述的生物传感器用于检测食品和水中的沙门氏菌。本申请所用到的序列为：HAP:5’-AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGATTGGCATTACTATGGGTCTCACTATG-3’S0:5’-AAAAGAACCCATAGTGAGACCCATGAACCCATAGTGAGACCCATAGTAATGCC-3’S1:5’-ATGGGTCTCACTATGGGTTCAACG-3’S2:5’-GTCTCACTATGGGTTCATGGGTCTCACTATGG-3’H1:5’-TGGGTAGGGCGGGTCGTTGAACCCATAGTGAGACCCATATGGGTCAAGACATGGGTCTCACTATGGGT-3’H2:5’-TGGGTAGGGCGGGTAGTGAGACCCATGTCTTGACCCATATGGGTTCAACGATGGGTCAAGACATGGGT-3’H3:5’-TGGGTAGGGCGGGTGTCTTGACCCATCGTTGAACCCATATGGGTCTCACTATGGGTTCAACGATGGGT-3’C:5’-CCCCCCCCCCCC-3’其中发卡探针HAP黑色斜体部分是沙门氏菌的适配体序列，发卡探针H1、H2、H3黑色加粗字体是劈开的G四连体序列。将S0探针、S1探针安1:2杂交合成复合探针S，当目标物存在时，目标物和适配体特异性结合，从而将HAP的发夹结构打开，打开的HAP可以绑定复合探针S的末端立足点区域，将S1从复合探针S上置换下来，同时暴露第二个立足区域，核酸链S2通过暴露的立足区域与其杂交，进一步将另一条S1及打开的HAP置换下来，置换下来的打开的HAP进行下一轮循环，进而得到大量S1，置换下来的S1可打开H1，打开的H1继续打开H2，打开的H2又可进一步打开H3，打开的H3又可将S1置换下来，实现了催化发夹自组装放大（CHA），同时使得形成G-四联体的序列暴露出来，在存在血红素时形成G-四联体/血红素DNA酶。运用G-四联体/血红素类辣根过氧化物酶的催化性能来将半胱氨酸氧化成胱氨酸，无法实现半胱氨酸与银簇之间的通过金硫键的电荷转移，从而调控荧光信号传导，从而实现沙门氏菌的定量检测。该专利技术的检测方式是荧光法检测，利用支点区域介导的链置换循环放大和CHA放大功能，产生大量G-四联体DNA酶，实现对半胱氨酸的氧化，使得荧光强度的显著变化。通过检测溶液的荧光强度进行目标物的检测。本专利技术利用了核酸适配体的特异型识别，实现了对目标物沙门氏菌的高特异性检测；利用支点区域介导的链置换循环放大，产生大量二级产物S1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测沙门氏菌的生物传感器，其特征在于，包括发夹探针HAP、复合探针S、核酸链S2、核酸链C、发卡探针H1、发卡探针H2、发卡探针H3、半胱氨酸、血红素、沙门氏菌和缓冲液；/n所述的复合探针S，由S0探针、S1探针1：2杂交成的双链；/n所述的HAP碱基系列如SEQ No.1所示；/n所述的S0碱基系列如SEQ No.2所示；/n所述的S1碱基系列如SEQ No.3所示；/n所述的S2碱基系列如SEQ No.4所示；/n所述的H1碱基系列如SEQ No.5所示；/n所述的H2碱基系列如SEQ No.6所示；/n所述的H3碱基系列如SEQ No.7所示；/n所述的C碱基系列如SEQ No.8所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测沙门氏菌的生物传感器，其特征在于，包括发夹探针HAP、复合探针S、核酸链S2、核酸链C、发卡探针H1、发卡探针H2、发卡探针H3、半胱氨酸、血红素、沙门氏菌和缓冲液；
所述的复合探针S，由S0探针、S1探针1：2杂交成的双链；
所述的HAP碱基系列如SEQNo.1所示；
所述的S0碱基系列如SEQNo.2所示；
所述的S1碱基系列如SEQNo.3所示；
所述的S2碱基系列如SEQNo.4所示；
所述的H1碱基系列如SEQNo.5所示；
所述的H2碱基系列如SEQNo.6所示；
所述的H3碱基系列如SEQNo.7所示；
所述的C碱基系列如SEQNo.8所示。


2.权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）复合探针S的构建；
（2）DNA银纳米簇AgNCs-DNA的合成；
（3）均相反应：将沙门氏菌与发夹探针HAP、复合探针S、核酸链S2、H1、H2、H3、AgNCs-DNA、半胱氨酸、血红素、缓冲液，混和均匀后孵育；
（4）荧光仪检测荧光强度。


3.根据权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉，李莎莎，刘素，黄加栋，张儒峰，赵一菡，瞿晓南，张雪，宋晓蕾，王海旺，王敬锋，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37