一种柱前衍生高效液相色谱-荧光检测器测定荞麦中D-荞麦碱的方法技术

本发明专利技术公开了一种柱前衍生高效液相色谱‑荧光检测器测定荞麦中D‑荞麦碱的方法。以芴甲氧酰氯为衍生试剂，pH＝8.5、20℃水浴反应20min进行衍生。采用岛津LC‑20A高效液相色谱仪，RF‑20A荧光检测器；TIANHE Kromasil C18(5μm,4.6mm×250mm)色谱柱；柱温为28℃；流动相为40：60(v/v)的乙腈：0.1％的乙酸水溶液；流速为1mL/min；激发波长为240nm，发射波长为315nm；分析时间为40min；进样量为10μL进行测定，并记录峰面积。采用外标法绘制D‑荞麦碱衍生物峰面积‑衍生物浓度标准曲线，进而计算得出样品中D‑荞麦碱的含量。

A method for the determination of d-buckwheat alkali in Buckwheat by high performance liquid chromatography fluorescence detector with pre column derivatization

【技术实现步骤摘要】
一种柱前衍生高效液相色谱-荧光检测器测定荞麦中D-荞麦碱的方法
本专利技术属于分析
，具体涉及一种柱前衍生高效液相色谱-荧光检测器测定荞麦中D-荞麦碱的方法。
技术介绍
D-荞麦碱(1,2-双脱氧野尻霉素)是一种六元环亚胺基环多醇，首次是从荞麦(荞麦，蓼科)种子里分离出来，也存在于其他植物如桑叶和枸杞中(GómezL，2012)。亚胺基环多醇，也称为亚胺糖，是碳水化合物的类似物，即碳水化合物的内环氧被氮取代，羟基的空间构型和糖(如，葡萄糖)一样，化学结构如下(GómezL，2012)。D-荞麦碱是肠道糖苷酶的抑制剂，可以调节餐后血糖浓度。因此，可以降低胰岛素抵抗和超重的风险(AmézquetaS，2013)。最近研究表明，D-荞麦碱在肠道运输中发挥着双重作用：首先，D-荞麦碱有效地延缓蔗糖和淀粉的分解，从而降低血糖浓度；其次，D-荞麦碱选择性的凝集肠杆菌科，如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌，促进益生菌粘附到肠粘膜(AmézquetaS，2013)。由于D-荞麦碱没有发色团，不能用简单的分光光度法测定其含量，所以要寻找其他的检测方法。有文献表明，气相色谱(GC)可以用于分离亚胺糖混合物，但是因为亚胺糖没有挥发性，所以需要先形成稳定的挥发性衍生物(AmézquetaS，2016)；在检测器的选择上，脉冲安培检测器-阴离子交换液相色谱也用于亚胺糖的检测，但是该技术的灵敏性和重现性较差(AmézquetaS，2016)；蒸发光散射检测器(ELSD)是一种检测糖的半通用检测器，应该也适用于亚胺糖的检测，但是ELSD需要很细致的样品前处理以避免干扰且ELSD-HPLC是在等度条件下分离、系统温度需要准确控制(AmézquetaS，2016)；在亚胺糖分析中，质谱(MS)是应用最广泛的检测方法，但是，该方法成本较高，而且所需的氨基柱也比较昂贵，一般实验室并不具备(AmézquetaS，2012)。所以，建立一种快速简单的测定方法是很必要的。而HPLC-UV和HPLC-FLD已经应用于分析衍生之后的亚胺糖，经9-芴(Fmoc)衍生之后，可以用反相C18色谱柱检测桑叶中的DNJ(AmézquetaS，2016)。基于对各种亚胺糖检测方法的比较，最终选择建立一种利用芴甲氧酰氯柱前衍生液相色谱-荧光检测器的方法。本专利技术的目的是针对现有技术存在的不足和缺陷。借助柱前衍生高效液相色谱-荧光检测器，建立一种D-荞麦碱的检测方法。本专利技术所提供的检测方法是通过柱前衍生高效液相色谱-荧光检测器法实现的，旨在解决现有方法大都依赖于高端分析检测仪器，检测成本高，方法难以普及应用的问题。AmézquetaS,GalánE,Vila-FernándezI,etal.ThepresenceofD-fagomineinthehumandietfrombuckwheat-basedfoodstuffs[J].Foodchemistry,2013,136(3):1316-1321.AmézquetaS,TorresJL.Advancesintheanalysisofiminocyclitols:Methods,sourcesandbioavailability[J].Talanta,2016,151:157-171.AmézquetaS,GalánE,FuguetE,etal.Determinationofd-fagomineinbuckwheatandmulberrybycationexchangeHPLC/ESI–Q-MS[J].Analyticalandbioanalyticalchemistry,2012,402(5):1953-1960.GómezL,Molinar-ToribioE,Calvo-TorrasMA,etal.D-Fagominelowerspostprandialbloodglucoseandmodulatesbacterialadhesion[J].TheBritishjournalofnutrition,2012,107(12):1739.
技术实现思路
本专利技术所述一种柱前衍生高效液相色谱-荧光检测器测定荞麦中D-荞麦碱的方法。具体步骤包括：(1)待测样品的配制：准确称取20g脱壳种子粉于500mL烧杯中，加入200mL蒸馏水，25℃、60W条件下超声波辅助提取10min，将提取物在3800g条件下离心10min，残渣重复提取一次，合并滤液，滤液经旋转蒸发定容到10mL，于4℃冰箱中贮藏备用。(2)D-荞麦碱标准溶液的配制：将2mg荞麦碱标准品溶于500μL超纯水中，得到浓度为4mg/mL的荞麦碱标准品母液，于4℃冰箱中贮藏备用。(3)衍生试剂的配制：称取适量芴甲氧酰氯配制成浓度为5mmol/L的芴甲氧酰氯的乙腈溶液。(4)衍生方法：取10μL标准工作液或样品于1.5mL离心管中，加入10μL浓度为0.4mol/L的硼酸钾缓冲液(pH8.5)，再加入20μL浓度为5mmol/L的芴甲氧酰氯的乙腈溶液，混合均匀后20℃水浴20min，然后加入10μL浓度为0.1mol/L的甘氨酸以终止反应，最后加入950μL浓度为0.1％的乙酸水溶液。(5)色谱条件：岛津LC-20A高效液相色谱仪配RF-20A荧光检测器；色谱柱：TIANHEKromasilC18(5μm,4.6mm×250mm)；柱温：28℃；流动相：乙腈/0.1％的乙酸水，40/60(v/v)；流速：1mL/min；激发波长：240nm，发射波长：315nm；进样量：10μL；分析时间：40min。(6)测定方法：a.激发波长与发射波长的确定：设定荧光分光光度计的激发波长为254nm，在200～400范围内扫描浓度为20μg/mL的标准工作液衍生物的发射波长，得到最大发射波长为314nm；以314nm设置发射波长，扫描该溶液的激发波长，得到最大激发波长为240nm和286nm。分别设定激发波长为240nm和286nm，得到激发波长为315nm。由于240nm为激发波长时较286nm为激发波长时的图谱较平稳，所以，最终选择240nm、315nm分别为液相-荧光分析时的激发波长和发射波长。b.将浓度为1、0.5、0.25、0.05、0.005mg/mL的标准工作液按(4)衍生方法衍生后用0.22μm针头过滤器过滤，按照(5)色谱条件测定D-荞麦碱标准工作液衍生物并记录峰面积，外标法绘制D-荞麦碱标准工作液衍生物峰面积-衍生物浓度标准曲线，得出标准曲线回归方程；c.将样品衍生物用0.22μm针头过滤器过滤，按照上述色谱条件测定样品中D-荞麦碱衍生物并记录峰面积，根据步骤上述得到的回归方程计算并得出样品中D-荞麦碱的含量。所述衍生试剂为芴甲氧酰氯。所述的待衍生物与芴甲氧酰氯用量为1:2(v/v)。所述的衍生反应温度为20℃。所述的衍生反应时间为20min。所述的衍生反应条件为pH＝8.5。所述色谱柱温度为28℃。所述流动相流速本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柱前衍生高效液相色谱-荧光检测器测定荞麦中D-荞麦碱的方法，其特征在于采用柱前衍生、高效液相色谱法进行测定，具体步骤包括：/n(1)荞麦样品的配制；/n(2)D-荞麦碱系列标准溶液的配制；/n(3)样品及D-荞麦碱系列标准溶液的衍生；/n(4)将D-荞麦碱系列标准溶液衍生物用0.22μm针头过滤器过滤，采用高效液相色谱法测定D-荞麦碱衍生物并记录峰面积，以外标法绘制D-荞麦碱系列标准溶液衍生物峰面积-衍生物浓度标准曲线，得出标准曲线回归方程；/n(5)将样品衍生物用0.22μm针头过滤器过滤，采用高效液相色谱法测定样品衍生物中D-荞麦碱并记录峰面积，根据步骤(4)中回归方程计算得出样品中D-荞麦碱的含量；/n所述色谱条件为：/n岛津LC-20A高效液相色谱仪配RF-20A荧光检测器；/n色谱柱：TIANHE Kromasil C18(5μm,4.6mm×250mm)；/n柱温：28℃；/n流动相：乙腈/0.1％的乙酸水，40/60(v/v)；/n流速：1mL/min；/n激发波长：240nm，发射波长：315nm；/n进样量：10μL；/n分析时间：40min。/n

【技术特征摘要】
1.一种柱前衍生高效液相色谱-荧光检测器测定荞麦中D-荞麦碱的方法，其特征在于采用柱前衍生、高效液相色谱法进行测定，具体步骤包括：
(1)荞麦样品的配制；
(2)D-荞麦碱系列标准溶液的配制；
(3)样品及D-荞麦碱系列标准溶液的衍生；
(4)将D-荞麦碱系列标准溶液衍生物用0.22μm针头过滤器过滤，采用高效液相色谱法测定D-荞麦碱衍生物并记录峰面积，以外标法绘制D-荞麦碱系列标准溶液衍生物峰面积-衍生物浓度标准曲线，得出标准曲线回归方程；
(5)将样品衍生物用0.22μm针头过滤器过滤，采用高效液相色谱法测定样品衍生物中D-荞麦碱并记录峰面积，根据步骤(4)中回归方程计算得出样品中D-荞麦碱的含量；
所述色谱条件为：
岛津LC-20A高效液相色谱仪配RF-20A荧光检测器；
色谱柱：TIANHEKromasilC18(5μm,4.6mm×250mm)；
柱温：28℃；
流动相：乙腈/0.1％的乙酸水，40/60(v/v)；
流速：1mL/min；
激发波长：240nm，发射波长：315nm；
进样量：10μL；
分析时间：40min。


2.根据权利要求1所述的一种柱前衍生高效液相色谱-荧光检测器测定荞麦中D-荞麦碱的方法，其特征在于：所述的衍生试剂为芴甲氧酰氯。


3.根据权利要求1所述的一种柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，朱瑞雪，韩林，王玉堂，方纯，彭强，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61