一种遗传性耳聋基因的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种遗传性耳聋基因的检测方法，属于基因检测的技术领域。其技术方案要点是，PCR扩增反应条件为：35‑37℃保温3‑5min，94‑95℃预变性3‑5min，95‑96℃变性30‑32s，55‑58℃退火30‑32s，68‑72℃延伸42‑46s，35‑38次循环，60‑65℃延伸8‑12min，该检测方法通过改变扩增反应的条件，减少基因芯片假阳性的结果，提高PCR产物的特异性程度，降低后期PCR扩增产物与探针杂交过程中假阳性出现的概率，提高基因芯片检测耳聋突变基因的准确性和灵敏性。

A detection method of hereditary deafness gene

【技术实现步骤摘要】
一种遗传性耳聋基因的检测方法
本专利技术涉及基因检测的
，特别涉及一种遗传性耳聋基因的检测方法。
技术介绍
耳聋是中国第一大残疾，其中遗传因素所致的耳聋约占60％。遗传性耳聋主要是指基因异常所致的耳聋，是人类最常见的感觉神经系统缺陷。这种疾病通过常染色体隐性，常染色体显性，X-连锁遗传和线粒体遗传方式遗传给下一代。国内耳聋分子流行病学研究表明，大部分非综合征型耳聋由以下4个基因突变引起：GJB2(35delG、176dell6、235delC及299delAT)、GJB3(538C>T)、SLC26A4(IVS7—2A>G、2168A>G)和线粒体DNA12SrRNA(1555A>G、C1494C>T)。随着分子遗传学技术的快速发展和基因芯片技术的广泛应用，耳聋芯片成为NSHL基因诊断的主要检测方法。通过对基因的识别可以预防先天性耳聋出生缺陷，控制药物致聋风险，预防或者延缓耳聋的发生发展。但目前运用基因芯片技术对耳聋基因进行检测时，PCR扩增过程中往往容易出现非特异性扩增，引起检测结果的假阳性，容易对后期的基因芯片杂交过程产生影响，影响了该检测技术的检测准确性。
技术实现思路
针对现有技术不足，本专利技术的目的在于：提供一种遗传性耳聋基因的检测方法，以达到提高基因芯片检测耳聋突变基因的准确性和灵敏性的效果。本专利技术的目的是通过以下技术方案得以实现的：一种遗传性耳聋基因的检测方法，包括以下步骤：(a)提取待测样本基因组DNA；(b)PCR扩增杂交产物：扩增反应条件为：35-37℃保温3-5min，94-95℃预变性3-5min，95-96℃变性30-32s，55-58℃退火30-32s，68-72℃延伸42-46s，35-38次循环，60-65℃延伸8-12min；(c)PCR产物与基因芯片杂交：制备磁珠、磁珠纯化、磁珠富集PCR产物、PCR产物变性、制备杂交反应混合物、芯片杂交；(d)基因芯片的洗涤与干燥；(e)基因芯片的结果分析；所述基因芯片含有遗传性耳聋突变基因的特异性探针。将人类的待测样本(如血液、血清或组织等)采用本领域通用的DNA提取方法提取基因组DNA，然后将待测样本提取的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，扩增得到的PCR产物经过磁珠吸附纯化后进行基因芯片杂交，以检测待测样本的DNA基因组中是否有突变的耳聋基因与探针结合，以此来确定被检侧的人体是否有耳聋的风险。通过采用上述方案，通过改变扩增反应的条件，先将待扩增的混合物保温一定的时间，使PCR扩增体系在适宜的温度稳定一段时间，使其中的DNA聚合酶在适宜的温度下激发活性，以便于后期扩增期间保持较高的活性，提高PCR扩增的效率。而且优化扩增中预变性和变性的温度和时间，可以明显地减少假阳性的结果；优化退火和延伸的时间和温度，使PCR的非特异性扩增降低，提高引物与模板的结合效率，提高PCR扩增的效率，提高PCR产物的特异性程度，降低后期PCR扩增产物与探针杂交过程中假阳性出现的概率，提高基因芯片检测耳聋突变基因的准确性和灵敏性。本专利技术进一步设置为：所述步骤(b)中，变性到退火之间的降温速率为0.4-0.8℃/s，退火到延伸之间的升温速率为0.2-0.6℃/s。通过采用上述方案，在变性过程中DNA双链打开完成之后，逐渐将温度以特定的速率降低至退火的温度，使引物更好地与解旋的DNA链结合；然后再升温至延伸的温度，使引物结合后DNA聚合酶按照模板合成新的链。优选降温和升温的速率，可以进一步提高PCR扩增反应的速率。本专利技术进一步设置为：所述步骤(b)中，PCR扩增体系包括：5×Buffer为5.0μl，上游引物为1.0μl，下游引物为2.0μl，dNTP为2.0μl，模板DNA为1.0μl，PrimeSTAR为0.3μl，ddH2O为13.7μl，总体积为25μl。通过采用上述方案，按照各组分的体积大小依次加入混合后配置成PCR扩增体系，其中5×Buffer有助于PrimeSTARDNA聚合酶的稳定，为DNA聚合酶提供一个最适合酶催化反应条件；上下游引物的功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链；dNTP可以提供核酸链组成的核苷酸原料。优化PCR扩增体系中各组分的配比，可以提高PCR扩增反应的效率。本专利技术进一步设置为：所述步骤(c)中，磁珠富集PCR产物的步骤包括：(i)将纯化后的磁珠与PCR产物吹吸5-10次混匀，静置5-8min，得到PCR产物-磁珠混合物；(ii)将产物-磁珠混合物用磁力吸附至溶液澄清，弃去溶液。通过采用上述方案，磁珠为纳米级磁珠微珠，其表面标记了一种官能团，可以与核酸DNA发生吸附反应，然后在磁场条件下可以发生聚集或分散。采用磁珠富集PCR产物，可以更好地将核酸DNA与蛋白质、多糖、脂肪等其它杂质分离，提高PCR产物的纯度，减少杂质对后续基因芯片检测结果的影响。本专利技术进一步设置为：所述步骤(c)中，基因芯片杂交的温度为45-55℃，时间为50-70min。通过采用上述方案，优选基因芯片的杂交温度和杂交时间，可以大大提高探针与待测样本的杂交效率，减少荧光染料在空气中被氧化的几率，提高杂交信号，进而提高基因芯片检测耳聋突变基因的准确性和灵敏性。本专利技术进一步设置为：所述步骤(d)中，基因芯片洗涤采用洗涤液进行洗涤；洗涤液包括洗涤液I和洗涤液II；洗涤液I，按体积百分比包括以下组分：ddH2O96-98％，20×SSC1.2-1.6％，10％SDS0.8-1.2％；洗涤液II，按体积百分比包括以下组分：ddH2O99-99.9％，20×SSC按照0.2-0.5％。本专利技术进一步设置为：所述步骤(d)中，基因芯片洗涤的洗涤程序包括以下步骤：(i)洗涤液I的洗涤条件：温度35-38℃，时间130-140s；(i)洗涤液II的洗涤条件：温度35-38℃，时间100-110s。通过采用上述方案，优选洗涤液和洗涤的条件，可以更好地洗去未结合的荧光物质，减少未结合的荧光物质对检测结果的影响，还能减少检测信号的损失。本专利技术进一步设置为：所述基因芯片至少包含一个阳性对照和一个阴性对照。本专利技术进一步设置为：所述阳性对照为多聚PolyT，阴性对照为ddH2O。通过采用上述方案，基因芯片上设置至少一个阳性对照和阴性对照，优选阳性对照和阴性对照的种类，可以通过阳性对照的结果和阴性对照的结果对比，减少基因芯片可以减少环境和人为因素造成的错误的诊断。本专利技术进一步设置为：所述上游引物和下游引物的0.1-0.5μM。通过采用上述方案，优选上游引物和下游引物的浓度在相同的浓度范围内，可以避免上游引物和下游引物浓度差距过大而造成的低效率的不对称扩增，进一步提高PCR扩增反应的效率。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：上述遗传性耳聋基因的检测方法，通过改变扩增反应的条件，减少假阳性的结果，提高P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种遗传性耳聋基因的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：/n（a）提取待测样本的基因组DNA；/n（b）PCR扩增杂交产物：扩增反应条件为：35-37℃保温3-5min，94-95℃预变性3-5min，95-96℃变性30-32s，55-58℃退火30-32s，68-72℃延伸42-46s，35-38次循环，60-65℃延伸8-12min；/n（c）PCR产物与基因芯片杂交：制备磁珠、磁珠纯化、磁珠富集PCR产物、PCR产物变性、制备杂交反应混合物、基因芯片杂交；/n（d）基因芯片的洗涤与干燥；/n（e）基因芯片的结果分析；/n所述基因芯片含有遗传性耳聋突变基因的特异性探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种遗传性耳聋基因的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）提取待测样本的基因组DNA；
（b）PCR扩增杂交产物：扩增反应条件为：35-37℃保温3-5min，94-95℃预变性3-5min，95-96℃变性30-32s，55-58℃退火30-32s，68-72℃延伸42-46s，35-38次循环，60-65℃延伸8-12min；
（c）PCR产物与基因芯片杂交：制备磁珠、磁珠纯化、磁珠富集PCR产物、PCR产物变性、制备杂交反应混合物、基因芯片杂交；
（d）基因芯片的洗涤与干燥；
（e）基因芯片的结果分析；
所述基因芯片含有遗传性耳聋突变基因的特异性探针。


2.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因的检测方法，其特征在于：所述步骤（b）中，变性到退火之间的降温速率为0.4-0.8℃/s，退火到延伸之间的升温速率为0.2-0.6℃/s。


3.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因的检测方法，其特征在于：所述步骤（b）中，PCR扩增体系包括：5×Buffer为5.0μl，上游引物为1.0μl，下游引物为2.0μl，dNTP为2.0μl，模板DNA为1.0μl，PrimeSTAR为0.3μl，ddH2O为13.7μl，总体积为25μl。


4.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因的检测方法，其特征在于：所述步骤（c）中，磁珠富集PCR产物的步骤包括：
（i）将纯化后的磁珠与PCR产物吹吸5-10次混匀，静置5-8min，得到PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：车万里，
申请(专利权)人：北京安博迪恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11