蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析制造技术

本发明专利技术提供一种蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法。所述方法为先用微量的胰蛋白酶酶解蛤蟆油，再通过DEAE阴离子交换色谱柱除去蛋白等杂质，并经透析、冻干、浓缩得到蛤蟆油糖胺聚糖（OR‑GAG）。糖胺聚糖由重复的二糖单元构成，通过肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ特异性酶解OR‑GAG，再利用分子排阻色谱法，得到硫酸乙酰肝素二糖/肝素二糖（HS/HP二糖）。HS/HP二糖经2‑氨基吖啶酮（AMAC）荧光标记后，利用反相色谱柱C

Extraction and structure analysis of heparin sulfate / heparin from toad oil

【技术实现步骤摘要】
蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析
本专利技术是关于蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析，属于天然产物制备纯化领域。
技术介绍
蛤蟆油为雌蛙输卵管干制品，呈不规则块状，以白色和黄白色为佳。蛤蟆油中约有50%粗蛋白、30%无氮浸出物、10%灰分、5%脂肪以及2%水分。清朝时期，蛤蟆油便已作为“八珍之首”的上等贡品敬献宫廷，其营养成分不亚于人参、燕窝等补品。蛤蟆油素有“补肾益精，养阴润肺”之功效，现代医学又发现，其具有增强机体免疫力、提高抗氧化能力、降血脂、抗癌辅助作用等。其中，降血脂之功效或与其含有硫酸乙酰肝素与肝素有关。硫酸乙酰肝素（HS）和肝素（HP）为糖胺聚糖（GAG）的一大分支，是由重复的二糖单元构成的聚阴离子线性长链。其中的二糖单元是由己糖醛酸（HexA）与葡萄糖胺（GlcN）以1-4糖苷键连接而成，HexA有两种结构，分别为葡萄糖醛酸（GlcA）和艾杜糖醛酸（IdoA）。二糖单元通常会有不同程度的硫酸化和乙酰化修饰，主要的修饰位点有HexA的C2位O硫酸化，GlcN的N位硫酸化和N位乙酰化，C6位O硫酸化，一些稀有结构会出现C3位O硫酸化。不同程度的硫酸化修饰影响HS/HP的生物功能，目前发现，HS/HP在细胞发育、血管生成、血液凝固、细胞黏附以及肿瘤代谢方面发挥着重要的作用。由于国内外未见报道有关蛤蟆油中HS/HP的提取与结构分析，本专利技术开创性的建立了一种提取蛤蟆油中HS/HP的方法，并首次对蛤蟆油中的HS/HP进行结构解析，为深入研究蛤蟆油中HS/HP的结构及其功效提供了原创性的提取途径和结构分析手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法。该方法以蛤蟆油为原料，经蛋白酶酶解、离心、DEAE分段洗脱提取得到糖胺聚糖（GAG）。然后，利用透析和冻干的方法除去盐和水，得到纯净的GAG。再分别用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ特异性酶解HS/HP至二糖单元，并通过分子排阻色谱柱S75柱对HS/HP二糖进行纯化，纯化后的二糖利用高温挥发除去流动相中的NH4HCO3，再用荧光物质AMAC（2-氨基吖啶酮）标记，利用ODS色谱柱对HS/HP二糖单元进行质谱结构分析，并根据HS/HP二糖组分的摩尔百分比建立HS/HP区域结构模型。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，包括以下步骤：（1）蛋白酶酶解蛤蟆油：粉末状蛤蟆油充分浸泡后用胰蛋白酶酶解，酶解后离心取上清液。（2）提取蛤蟆油中的糖胺聚糖：利用DEAE纤维素树脂的阴离子交换作用，置换出蛤蟆油上清液中的糖胺聚糖；透析除去蛤蟆油糖胺聚糖中大量的盐，冻干除去水分。（3）酶解糖胺聚糖获取二糖组分：用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ特异性酶解蛤蟆油糖胺聚糖得到蛤蟆油硫酸乙酰肝素/肝素HS/HP二糖。（4）分子排阻色谱纯化二糖组分：利用液相分子排阻色谱柱S75柱纯化HS/HP二糖。（5）LC-MS法分析蛤蟆油中HS/HP二糖组分的结构：液相纯化后的二糖经AMAC（2-氨基吖啶酮）和NaBH3CN衍生化处理后，通过质谱分析得到二糖结构及其组分含量，并建立HS/HP区域结构模型。蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，包括以下具体步骤：(1)蛋白酶酶解蛤蟆油：研磨成粉末状的蛤蟆油在充分浸泡后，加入胰蛋白酶酶解，酶解后的蛤蟆油离心取上清液。(2)提取蛤蟆油中的糖胺聚糖：将DEAE柱水洗平衡至稳定状态，加入上清液，再加入平衡液除去蛋白质杂质，然后再用不同高盐浓度洗脱液将糖胺聚糖分段洗脱出来。最后将每管收集到的样品进行紫外检测；利用透析将糖胺聚糖中大量的盐除去，随后利用冻干除去水分。(3)酶解糖胺聚糖获取二糖组分：利用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ将糖胺聚糖酶解至HS/HP二糖单元，再用沸水灭活，离心取上清液。(4)分子排阻色谱纯化二糖组分：取步骤(3)中的上清液，通过分子排阻色谱法利用S75柱对样品进行分离、纯化，从而获得纯净的HS/HP二糖组分。(5)LC-MS法分析蛤蟆油中HS/HP二糖组分的结构：用AMAC（2-氨基吖啶酮）和氰基硼氢化钠对蛤蟆油中HS/HP二糖进行荧光标记，标记后的HS/HP和CS/DS二糖用MS方法进行分析；根据建立好的标准曲线，得到蛤蟆油中HS/HP的组分含量，并建立HS/HP区域结构模型。进一步的，步骤（1）蛋白酶酶解蛤蟆油具体为：用研钵将蛤蟆油研磨至粉末状，取100-200mg浸泡在10-50mL超纯水中，常温放置24-48h使其充分溶胀；取100μL10-30μg/μL的胰蛋白酶溶液（酶缓冲液为0.2MNaCl，10-50mM磷酸缓冲液），分次加入到蛤蟆油样品中，反应温度36-40℃，反应时长24-48h。酶解结束，10000rpm离心10-20min取上清液。进一步的，步骤（2）提取蛤蟆油中的糖胺聚糖具体为：用足量的超纯水洗去DEAE树脂中的乙醇，取5-20mL装柱，用十倍柱体积的0.2MNaCl，10-50mM磷酸平衡缓冲液平衡DEAE柱，上样，再加入平衡缓冲液除去蛋白杂质，随后利用分段洗脱的方法提取蛤蟆油中的糖胺聚糖，分段洗脱的不同高盐浓度洗脱液分别为0.5MNaCl，10-50mM磷酸缓冲液；1.0MNaCl，10-50mM磷酸缓冲液，以3mL/管收集各馏分，并进行紫外检测，波长为212nm；DEAE收集到的馏分用1000-5000Da的透析膜透析除去洗脱液中的NaCl，每两小时换一次去离子水，透析2-4天，冻干2-4天除去水，得到纯净的蛤蟆油糖胺聚糖(OR-GAG)。进一步的，步骤（3）酶解糖胺聚糖获取二糖组分具体为：将步骤（2）提取获得的蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG取0.5-1.0μg，然后加入肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ酶液，各10μL，酶的浓度均为0.1-1.0mIU/μL；将蛤蟆油糖胺聚糖OR-GAG特异性酶解至HS/HP二糖单元，酶解温度为36-40℃，酶解时长24-48h，酶解结束后，10000rpm离心取上清液。进一步的，步骤（4）分子排阻色谱纯化二糖组分具体为：取步骤（3）中的上清液，以≤200μL的上样体积过分子排阻色谱柱，HS/HP二糖经S75柱分离纯化，流动相为0.1-0.3MNH4HCO3，流速0.4mL/min，HS/HP二糖在38-44min出峰并进行收集；流动相中的NH4HCO3通过55-65℃挥发除去。进一步的，步骤（5）LC-MS法分析蛤蟆油中HS/HP二糖组分的结构具体为：步骤（4）纯化后的蛤蟆油HS/HP二糖经AMAC（2-氨基吖啶酮）荧光标记后，以上样量<20μL过ODS柱，流动相A相为20-80mM醋酸铵，pH=5-7，流动相B相为100%甲醇，流速为0.3mL/min，CDL为100-200℃，HeatBlock为100-200℃，N2流速为1.5mL/min,检测电压为1.6-1.8kV。利用标准曲线分析二糖组分，并建立HS/HP区域模型。本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）蛋白酶酶解蛤蟆油：粉末状蛤蟆油充分浸泡后用胰蛋白酶酶解，酶解后离心取上清液；/n（2）提取蛤蟆油中的糖胺聚糖：利用DEAE纤维素树脂的阴离子交换作用，置换出蛤蟆油上清液中的糖胺聚糖；透析除去蛤蟆油糖胺聚糖中大量的盐，冻干除去水分；/n（3）酶解糖胺聚糖获取二糖组分：用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ特异性酶解蛤蟆油糖胺聚糖得到蛤蟆油硫酸乙酰肝素/肝素HS/HP二糖；/n（4）分子排阻色谱纯化二糖组分：利用液相分子排阻色谱柱S75柱纯化HS/HP二糖；/n（5）LC-MS法分析蛤蟆油中HS/HP二糖组分的结构：液相纯化后得到的二糖经2-氨基吖啶酮和氰基硼氢化钠衍生化处理后，通过质谱分析得到二糖结构及其组分含量，并建立HS/HP区域结构模型。/n

【技术特征摘要】
1.蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）蛋白酶酶解蛤蟆油：粉末状蛤蟆油充分浸泡后用胰蛋白酶酶解，酶解后离心取上清液；
（2）提取蛤蟆油中的糖胺聚糖：利用DEAE纤维素树脂的阴离子交换作用，置换出蛤蟆油上清液中的糖胺聚糖；透析除去蛤蟆油糖胺聚糖中大量的盐，冻干除去水分；
（3）酶解糖胺聚糖获取二糖组分：用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ特异性酶解蛤蟆油糖胺聚糖得到蛤蟆油硫酸乙酰肝素/肝素HS/HP二糖；
（4）分子排阻色谱纯化二糖组分：利用液相分子排阻色谱柱S75柱纯化HS/HP二糖；
（5）LC-MS法分析蛤蟆油中HS/HP二糖组分的结构：液相纯化后得到的二糖经2-氨基吖啶酮和氰基硼氢化钠衍生化处理后，通过质谱分析得到二糖结构及其组分含量，并建立HS/HP区域结构模型。


2.根据权利要求1所述的蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)蛋白酶酶解蛤蟆油：研磨成粉末状的蛤蟆油在充分浸泡后，加入胰蛋白酶酶解，酶解后的蛤蟆油离心取上清液；
(2)提取蛤蟆油中的糖胺聚糖：将DEAE柱水洗平衡至稳定状态，加入上清液，再加入平衡液除去蛋白质杂质，然后再用不同高盐浓度洗脱液将糖胺聚糖分段洗脱出来；最后将每管收集到的样品进行紫外检测；利用透析将糖胺聚糖中大量的盐除去，随后利用冻干除去大部分的水；
(3)酶解糖胺聚糖获取二糖组分：利用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ将糖胺聚糖酶解至HS/HP二糖单元，再用沸水灭活，离心取上清液；
(4)分子排阻色谱纯化二糖组分：取步骤(3)中的上清液，通过分子排阻色谱法利用S75柱对样品进行分离、纯化，从而获得纯净的HS/HP二糖组分；
(5)LC-MS法分析蛤蟆油中HS/HP二糖组分的结构：用2-氨基吖啶酮AMAC和氰基硼氢化钠对蛤蟆油中HS/HP二糖进行荧光标记，标记后的HS/HP和CS/DS二糖用MS方法进行分析；根据建立好的标准曲线，得到蛤蟆油中HS/HP的组分含量，并建立HS/HP区域结构模型。


3.根据权利要求2所述的蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析方法，其特征在于，步骤（1）蛋白酶酶解蛤蟆油具体为：用研钵将蛤蟆油研磨至粉末状，取100-200mg浸泡在10-50mL超纯水中，常温放置24-48h使其充分溶胀；取100μL10-30μg/μL的胰蛋白酶溶液，加入到蛤蟆油样品中，反应温度36-40℃，反应时长24-48h，酶解结束，100...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏峥，黄海月，林江慧，梁群焘，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35