转氨酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种转氨酶突变体及其应用。其中，该转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：G17V，L36P，Q40H，G69Y，H70T，L73A，V77G，V77S，V77T，A78I，Y130M，Y130V，Y130T，N132I，N132T，K141S，K142S，K142T，R143P，G144F，G144W，G144Y，E145D，E145S，E145G，K146R，L148A，L148I等。本发明专利技术的转氨酶突变体获得了对羰基底物的催化活力。

Transaminase mutant and its application

【技术实现步骤摘要】
转氨酶突变体及其应用
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。
技术介绍
光学纯胺和a-和b-氨基酸在生物体中起着关键作用。这些化合物在医药应用中也非常重要，是合成手性药物和天然产物等的重要中间体。含手性因素的化学药物的对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性存在显著的差异，当前手性药物的研究已成为国际新药研究的主要方向之一。手性胺是合成多种生物活性化合物和活性药物成分的重要组成部分，据估计，目前40％的药物都是手性胺及其衍生物，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等的合成都是以手性胺作为中间体(Top.Catal.2014,57,284-300)，使得手性胺化合物成为制药业的重要组成部分。手性胺的工业生产有多种，主要依赖于烯酰胺从酮前体的金属催化氢化，过程需要昂贵的过渡金属配合物作为催化剂，由于这些过渡金属配合物资源有限，因此难以实现可持续性。同时，从酮前体经不对称合成手性胺的过程需要胺的保护和脱保护步骤，增加步骤和废物，降低收率。催化加氢还原法合成手性胺的方法中催化剂的制备困难而且价格昂贵，设备投资大，生产成本高，对催化剂活性和加氢条件要求很高，而且催化剂有毒性，尤其是氢气中的硫化物，极易发生人员中毒。转氨酶是一类以蛋白质为主体的生物催化剂。转氨酶是以磷酸吡哆醛为辅因子，能够催化1个氨基供体(氨基酸或胺)上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺或其副产物酮或α-酮酸的酶类的总称。由于传统的不对称合成胺的化学方法存在不同的局限性，例如低效率，低选择性和对环境污染较严重等问题，同时转氨酶催化合成手性胺具有很高的立体和化学选择性，具有安全性和环境相容性，是绿色环保的过程，一步催化到位，具有化学方法不可比拟的优势，转氨酶合成手性化合物成为一种关键的不对称合成技术。天然的转氨酶的底物谱往往较窄，只能催化特定类型的底物生成手性胺，而在生物活性化合物或活性药物合成过程中，需要多种类型的手性胺为原料进行合成，因此限制了转氨酶的广泛应用。同时，工业生产过程中往往需要在一定的有机溶剂、压力、pH等易使蛋白质变性的条件，因此需要所用的生物催化剂具有较高的稳定性，以适应工业化生产需要。而野生转氨酶往往在苛刻条件下较易失活，稳定性较差，从而限制了其广泛应用。尽管使用转氨酶生产手性胺的进展已被高度关注，但酶促方法在制备手性胺化合物的应用中存在很多问题。如对空间位阻大的底物无催化活力；酶活性低及酶用量大导致发酵成本增加；反应体系中稳定性不高易失活等。因此需要对天然转氨酶进行改造，扩大其底物谱，使其获得催化空间位阻较大的底物的能力，同时提高其稳定性，以提高其应用价值。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种转氨酶突变体及其应用，以解决现有技术中SsTA蛋白对空间位阻较大的羰基底物没有催化活力的技术问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种转氨酶突变体。该转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：G17V，L36P，Q40H，G69Y，H70T，L73A，V77G，V77S，V77T，A78I，Y130M，Y130V，Y130T，N132I，N132T，K141S，K142S，K142T，R143P，G144F，G144W，G144Y，E145D，E145S，E145G，K146R，L148A，L148I，L148T，L151A，L151H，L151E，L151V，L151Q，T152R，H153P，H153G，Y158S，I160C，L163Q，L163R，A165I，P167S，E170R，T175A，P180A，Y198F，S207I，T290S，T290G，A292G，Y198M，R216Q，R216E，R216S，S217N，W200A，F208R，F208L和F208V；或者转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。进一步地，转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少还包括如下突变位点之一：T66M，T66A，T66Q，T66S，E105D，T134A，K150N，G187S，R188L，Y158N，I160F，I160L，I160V，Y162F，T204N，T204S，K211H，K211Q，L237Q，A242T，V244M，V244S，V244D，V244N，V244H，V244E，V244A，Y260F，Y260N，E261D，T270A，R273S，R273C，R273T，S278R，D327M和E282K；或者转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。进一步地，突变至少还包括如下突变位点组合之一：L73A+V77G+T290S，H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+R143P+S207I+T290S+A292G或H70T+L73A+V77G+G144F/Y/W+S207I。进一步地，突变至少包括如下突变位点组合之一：G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144W+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198M、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198M、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+R216Q、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+R216S、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198F、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+F208R、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+T204N、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括如下突变位点之一：G17V，L36P，Q40H，G69Y，H70T，L73A，V77G，V77S，V77T，A78I，Y130M，Y130V，Y130T，N132I，N132T，K141S，K142S，K142T，R143P，G144F，G144W，G144Y，E145D，E145S，E145G，K146R，L148A，L148I，L148T，L151A，L151H，L151E，L151V，L151Q，T152R，H153P，H153G，Y158S，I160C，L163Q，L163R，A165I，P167S，E170R，T175A，P180A，Y198F，S207I，T290S，T290G，A292G，Y198M，R216Q，R216E，R216S，S217N，W200A，F208R，F208L和F208V；或者所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。/n...

【技术特征摘要】
1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括如下突变位点之一：G17V，L36P，Q40H，G69Y，H70T，L73A，V77G，V77S，V77T，A78I，Y130M，Y130V，Y130T，N132I，N132T，K141S，K142S，K142T，R143P，G144F，G144W，G144Y，E145D，E145S，E145G，K146R，L148A，L148I，L148T，L151A，L151H，L151E，L151V，L151Q，T152R，H153P，H153G，Y158S，I160C，L163Q，L163R，A165I，P167S，E170R，T175A，P180A，Y198F，S207I，T290S，T290G，A292G，Y198M，R216Q，R216E，R216S，S217N，W200A，F208R，F208L和F208V；或者所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少还包括如下突变位点之一：T66M，T66A，T66Q，T66S，E105D，T134A，K150N，G187S，R188L，Y158N，I160F，I160L，I160V，Y162F，T204N，T204S，K211H，K211Q，L237Q，A242T，V244M，V244S，V244D，V244N，V244H，V244E，V244A，Y260F，Y260N，E261D，T270A，R273S，R273C，R273T，S278R，D327M和E282K；或者所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。


3.根据权利要求1所述的转氨酶突变体，其特征在于，所述突变至少还包括如下突变位点组合之一：L73A+V77G+T290S，H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+R143P+S207I+T290S+A292G或H70T+L73A+V77G+G144F/Y/W+S207I。


4.根据权利要求3所述的转氨酶突变体，其特征在于，所述突变至少包括如下突变位点组合之一：G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144W+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198M、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198M、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+R216Q、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+R216S、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198F、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+F208R、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+T204N、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+K211H、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+F144W+Y198F、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144W+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198F+K211H、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+A165I+Y130M+163Q+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+Y198F+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+Y158S+I160C+N132T+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+Y158S+I160C+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+L148A+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+L148I+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+L151A+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+P180A+A165I+Y130M+L163Q+F208R+S207I+K211H+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144F+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144F+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163R+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+Y130V+K141S+K142T+R143P+G144F+E145D+L148T+L151A+A165I+LL163Q+F208R+S207I+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+Y130T+L163Q+A165I+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+A165I+Y130V+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163R+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+T152R+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+S207I+T290S+A292G+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+L148A+L151A+T152R+M130V、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141T+K142S+R143P+G144Y+L148A+L151A+P167S+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+T152R+A165I+Y130V+L163Q+K211H+F208R+R188L+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+T152R+R188L+A165I+L163Q+Y130V+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G+G17V+Q40H+T204S、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+T152R+R188L+A165I+Y130V+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G+T204S、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+A165I+Y130V+L163Q+L148A+L151A+T152R+R188L+T204S+S207I+K211H+F208R+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+E145S+Y130V+L148A+L151A+T152R+L163Q+A165I+R188L+T204S+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141T+K142S+R143P+G144Y+K146R+E145G+Y130V+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+T204S+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+A165I+Y130M+163Q+L148A+L151E+T152R+R188L+T204S+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T204S+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+Y130M+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+T204S+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151E+T152R+L163Q+A165I+R188L+T204S+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+Y198F+T204S+F208R+S207I+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66Q+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151A+T152R+L163Q+A165I+R188L+T204S+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+T66A+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151A+T152R+L163Q+A165I+G187S+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66Q+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151A+T152R+L163Q+A165I+R188L+K211H+F208R+T204S+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+E105D+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151A+T152R+L163Q+A165I+R188L+T204S+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+E145G+A165I+Y130V+L163Q+L148A+L151A+T152R+R188L+T204S+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130M+K146R+E145G+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+T204N+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130M+K146R+E145G+L148A+L151V+H153P+T152R+A165I+L163Q+R188L+T204S+S207I+K211H+F208R+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130M+K146R+E145G+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+T204N+S207I+V244M+K211H+F208R+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130M+K146R+E145G+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+T204N+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G+S278R、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+K146R+E145G+Y130M+L148A+L151H+T152R+H153P+I16...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯·盖吉，肖毅，刘芳，张娜，王祖建，颜俊杰，史皖明，张慕姣，刘冶，
申请(专利权)人：凯莱英医药化学阜新技术有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21