一种带赖氨酸标签的ADAMTS13底物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种带赖氨酸标签的ADAMTS13底物，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，并具有被ADAMTS13酶切的蛋白活性。本发明专利技术所提供的ADAMTS13酶切底物，可以在体外高效大量表达纯化，并且不用做荧光修饰，进一步降低其成本，可大量应用于实际临床；并且本发明专利技术的底物分别带有两组不同的标签，不仅可以作为蛋白纯化时的标签工具，而且被ADAMTS13酶切后产生的产物各自带有一个赖氨酸标签或GST标签，两个产物均可以被针对该标签的ELISA试剂盒检测出来。本发明专利技术所提供新的ADAMTS13酶切底物可以高效被ADAMTS13酶切，可应用于检测ADAMTS13的活性高低。

ADAMTS13 substrate with lysine label and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种带赖氨酸标签的ADAMTS13底物及其制备方法和应用
本专利技术属于生物技术分子克隆领域，涉及一种带赖氨酸标签的ADAMTS13底物及其制备方法和应用。
技术介绍
1996年首次报道了VWF裂解蛋白酶(VonWillebrandfactorcleavingprotease,vWF-cp)的存在，vWF-cp是具凝血酶敏感蛋白结构的去整合素域和金属蛋白酶域蛋白(ADAMTS)家族成员之一,命名为ADAMTS-13。I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白酶(ADisintegrinAndMetalloproteasewithThromboSpondintypeImotif,ADAMTS)13，属于含I型血小板反应蛋白的解聚素和金属蛋白酶家族成员之一,，为人血管性血友病因子(vonWillebrandfactor，vWF)裂解蛋白酶，主要由肝脏星状细胞合成。ADAMTS13于2001年首次发现并克隆，为存在血浆中的一种重要金属蛋白酶，近期研究发现，血管内皮细胞、巨噬细胞、血小板和肾脏多种细胞均表达ADAMTS13，并在多种疾病中发现其水平异常，ADAMTS13最早因与血栓性血小板减少性紫癫(TTP)的关系被发现，TTP患者常常由于ADAMTS13基因缺陷或体内存在抗ADAMTS13的自身抗体导致ADAMTS13活性缺乏，进而引起循环中超大VWF多聚体(ULVWF)累积、血小板聚集和微血栓形成。此外目前认为与炎症反应也有关系，子痫前期、恶性肿瘤和肝脏疾病等患者也出现血浆ADAMTS13活性的异常。这提示ADAMTS13可能通过作用于VWF或者其他机制，参与各种临床疾病的发生与发展。随着研究的深入，ADAMTS13与心血管疾病的关系引起普遍关注，其参与多种心血管疾病的发生和发展。研究表明，败血症和DIC等炎症性疾病患者血浆VWF抗原水平升高、ADAMTS13活性水平降低。血浆ADAMTS13和VWF水平与炎症性疾病的严重程度、器官功能失调和疾病转归相关。所以作为功能性蛋白，ADAMTS13活性高低的检测就极为重要。目前广泛应用的ADAMTS13活性检测方法是荧光标记VWF73底物荧光共振能量转移试验(FRET)，该方法实验步骤简单快捷，利用化学合成的含有D1596-R1668的73个氨基酸的vWF片段，其中的氨基酸Q1599跟N1610被荧光基团A2pr(Nma)和A2pr(Dnp)修饰，当样品中存在ADAMTS13的时候，ADAMTS13将会特异性的剪切底物的Y1605跟M1606之间的肽键，从而消除了Nma对Dnp的影响，从而可以在440nm检测到荧光(BritishJournalofHaematology,129,93-100)。该方法虽然有着其快速简便的一系列优点，但是由于化学合成底物的成本太高，所以无法广泛应用于临床，同时因为该方法最终检测的是荧光信号，因此病人样本的颜色会对检测结果造成一定的影响，从而影响疾病的判断。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种带赖氨酸标签的ADAMTS13底物，还提供带赖氨酸标签的ADAMTS13底物GST-vWF73-11Lys的制备方法和应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.一种带赖氨酸标签的ADAMTS13底物，所述ADAMTS13底物的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。进一步，所述ADAMTS13底物具有被ADAMTS13酶切的蛋白活性。进一步，编码ADAMTS13底物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。2.专利技术目的之二还提供一种带赖氨酸标签的ADAMTS13底物的制备方法，其具体步骤如下：a.以核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的cDNA为反应模板进行PCR扩增反应；b.再将步骤a得到的PCR扩增反应产物及载体进行酶切，并将PCR反应产物构建到载体上得到重组载体；c.将所述重组载体转化至感受态细胞中，培养并挑选阳性克隆；d.再将阳性克隆转染至表达细菌株，并进行诱导培养，可表达得到带赖氨酸标签的ADAMTS13底物。进一步，PCR反应体系包括1uM的引物各2.5uL，10ng的cDNA1uL，45uLPCR混合物。进一步，PCR扩增反应的条件为94℃变性30秒，50℃复性30秒，72℃延伸30秒，反应40个循环以后终止反应。进一步，PCR扩增反应的引物对序列为SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。进一步，步骤b中载体为pGEX6p-1，酶切为以BamHI和EcoRI进行双酶切，37℃水浴4个小时。进一步，重组载体的构建方法为酶切后的PCR扩增产物和载体质粒以5：1的比例混合，加入T4连接酶，进行连接反应，16℃孵育16个小时。进一步，所述感受态细胞为DH5a，所述表达细菌株为大肠杆菌BL21。进一步，步骤d中阳性克隆转染至表达细菌株，还可以先小量表达挑选阳性表达克隆。具体的，将阳性克隆转染至表达细菌株后，在含有100ug/ml的LB琼脂糖平板上37℃孵育24小时；挑选2-3个克隆，分别用LB培养液小剂量约5ml培养，至吸光值OD600达到0.5左右，加入IPTG至1mM，继续37度震荡培养2个小时；收集菌体，加热裂解以后，通过SDS-PAGE电泳，利用抗GST的抗体验证表达阳性的克隆。进一步，所述制备方法还包括收集诱导培养后的菌体，加入溶菌酶并超声裂解，4℃高速离心以后收集上清；再将上清液依次利用GlutathioneSepharose4B和Ni-NTA亲和柱进行纯化，得到纯化后的带赖氨酸标签的ADAMTS13底物。3.氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的带赖氨酸标签的ADAMTS13底物在制备检测ADAMTS13试剂盒中的应用。本专利技术的底物两端分别带有GST和赖氨酸两组不同的标签，酶切产生的产物各自带有一个特异性的标签，这样两个酶切产物均可以被针对该标签的ELISA试剂盒检测出来，进一步可检测ADAMTS13的水平高低。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一个新型的ADAMTS13酶切底物，具有以下优点：1，可以在体外高效大量表达纯化，跟化学合成相比较而言，其成本大大降低，并且不用做荧光修饰，进一步降低其成本，可大量应用于实际临床；2，本专利技术的底物有C端跟N端分别带有GST和赖氨酸两组不同的标签，都可以作为蛋白纯化时的标签工具，因此该底物蛋白可以经过两次不同的原理进行纯化，从而其纯度可以达到98％以上；而且都是亲和纯化，保证纯化的收率。3，本专利技术的底物两端分别带有GST和赖氨酸两组不同的标签，这样酶切后产生的产物各自带有一个不同特异性的标签，两个产物均可以被针对该标签的ELISA试剂盒检测出来；4，本专利技术的底物发生酶切以后的C端产物分子量仅为8308道尔顿，可以被质谱的检测到。本专利技术所提供新型的ADAMTS13酶切底物可以高效被ADAMTS13酶切，实验结果显示100ng的ADAMTS13可以高效的酶切10ug的GST-vWF73-11Lys底物蛋白。附图说明<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种带赖氨酸标签的ADAMTS13底物，其特征在于，所述ADAMTS13底物的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种带赖氨酸标签的ADAMTS13底物，其特征在于，所述ADAMTS13底物的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.根据权利要求1所述的带赖氨酸标签的ADAMTS13底物，其特征在于，所述ADAMTS13底物具有被ADAMTS13酶切的蛋白活性。


3.根据权利要求1所述的带赖氨酸标签的ADAMTS13底物，其特征在于，编码ADAMTS13底物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


4.权利要求1-3任一项带赖氨酸标签的ADAMTS13底物的制备方法，其特征在于，制备方法的具体步骤如下：
a.以核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的cDNA为反应模板进行PCR扩增反应；
b.再将步骤a得到的PCR扩增反应产物及载体进行酶切，并将PCR反应产物构建到载体上得到重组载体；
c.将所述重组载体转化至感受态细胞中，培养并挑选阳性克隆；
d.再将阳性克隆转染至表达细菌株，并进行诱导培养，可表达得到带赖氨酸标签的ADAMTS13底物。


5.根据权利要求4所述带赖氨酸标签的ADAMTS13底物的制备方法，其特征在于，PCR扩增反应的条件为94℃变性3...

【专利技术属性】
技术研发人员：晏妮，
申请(专利权)人：浙江壹晨生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33