包封免疫刺激性核酸的自组装蛋白纳米粒子制造技术

本发明专利技术涉及包封免疫刺激性核酸的自组装蛋白纳米粒子。此外，本发明专利技术涉及这些纳米粒子用于疫苗接种的用途。

Self-assembled protein nanoparticles encapsulating immunostimulatory nucleic acids

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包封免疫刺激性核酸的自组装蛋白纳米粒子
本专利技术涉及包封免疫刺激性核酸的自组装蛋白纳米粒子。此外，本专利技术涉及这些纳米粒子用于疫苗接种的用途。
技术介绍
CpG–TLR9含有胞嘧啶紧随其后是鸟嘌呤的短单链合成DNA分子被称为CpG寡脱氧核苷酸(或CpGODN)。所述“p”是指两个连续核苷酸之间的磷酸二酯键，这与双链DNA中的CG碱基配对完全不同，尽管一些合成的ODN代之以具有修饰的硫代磷酸酯骨架以提高它们的体内稳定性。当这些CpG基序的胞嘧啶未甲基化时，它们可以充当免疫刺激性分子。由于它们在微生物基因组中的丰富性与它们在脊椎动物基因组中的相对稀有性形成鲜明对比——在哺乳动物中所有CpG配对中的约70％至80％的胞嘧啶是甲基化的，因此CpG基序被认为是与病原体相关的分子模式(PAMP)。所述CpGPAMP被所谓的模式识别受体Toll样受体9(TLR9)识别。TLR9是识别来自于细菌和病毒两者的DNA的toll样受体，而TLR3、TLR7和TLR8识别病原体来源的RNA。TLR9仅在高等灵长类动物和人中的浆细胞样树突状细胞和B细胞中组成性表达，因此在人中未甲基化的CpG二核苷酸位点可以被这些细胞上的TLR9检测。这被免疫系统用于检测细胞内感染。RNA病原体来源的RNA也被toll样受体识别。TLR3识别主要来自于带有双链RNA基因组的病毒的双链RNA和多聚I:C(polyI:C)；TLR7识别来自于RNA病毒的单链RNA，而TLR8识别小的合成化合物、单链病毒RNA和被吞噬的细菌RNA。>TLR3最常用的实验性TLR3激动剂是polyI:polyC(pIC)。pIC是一种模拟双链RNA(dsRNA)的大的合成聚合复合物。pIC的制备物在链长的分布、溶解性和其他生物学性质包括毒性方面各不相同。实验研究显示，TLR3可以在癌细胞中触发凋亡。此外，在细胞质中存在其他结合dsRNA的受体例如MDA5和RIG-I，它们在癌细胞中也可以结合pIC并对凋亡有贡献。TLR3诱导凋亡并在同时活化免疫系统的能力，使TLR3配体例如pIC成为用于癌症治疗的有吸引力的治疗选项。TLR7和TLR81.位于胞内体中的TLR7和TLR8识别单链RNA(ssRNA)。这是被免疫细胞例如巨噬细胞或树突状细胞内化的ssRNA病毒例如流感病毒、仙台病毒和柯萨奇B型病毒的基因组的共同特点。尽管TLR7可以识别富含GU的ssRNA，但ssRNA中富含GU的序列的存在不足以刺激TLR7。咪喹莫特是一种通过与TLR7相互作用充当免疫应答调节剂的处方药。咪喹莫特被用于治疗表浅性基底细胞癌、生殖器疣和光化性角化病。瑞喹莫德(R-848)和嘎德莫特是咪喹莫特的衍生物。
技术实现思路
第一方面，本专利技术涉及一种用于在对象中诱导免疫应答的组合物，其包含：(a)由多个下式(I)的构件构成的自组装蛋白纳米粒子(SAPN)，X1–ND1–L1–ND2–Y1(I)，所述式(I)的构件由包含卷曲螺旋寡聚化结构域ND1、连接物L1、卷曲螺旋寡聚化结构域ND2和其他取代基X1和Y1的连续链构成，其中ND1是包含m个亚基ND1的寡聚物(ND1)m的卷曲螺旋寡聚化结构域，ND2是包含n个亚基ND2的寡聚物(ND2)n的卷曲螺旋寡聚化结构域，m和n各自为2至10之间的数字，前提是m不等于n并且不是n的倍数，并且n不是m的倍数，L1是在生理条件下具有至少+2的总正电荷的肽连接物，X1不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，Y1不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，其中所述多个式(I)的构件任选地与多个下式(II)的构件共同组装，X2–ND3–L2–ND4–Y2(II)所述式(II)的构件由包含卷曲螺旋寡聚化结构域ND3、连接物L2、卷曲螺旋寡聚化结构域ND4和其他取代基X2和Y2的连续链构成，其中ND3是包含y个亚基ND3的寡聚物(ND3)y的卷曲螺旋寡聚化结构域，ND4是包含z个亚基ND4的寡聚物(ND4)z的卷曲螺旋寡聚化结构域，y和z各自为2至10之间的数字，前提是y不等于z并且不是z的倍数，并且z不是y的倍数，并且其中ND3与ND1一致，或者ND4与ND2一致，或者ND3和ND4两者分别与ND1和ND2一致，L2是在生理条件下具有至少+2的总正电荷的肽连接物，X2不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，Y2不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，(b)免疫刺激性物质，其中所述免疫刺激性物质是核酸衍生物，其中所述核酸衍生物被包封在所述SAPN中。第二方面，本专利技术涉及一种疫苗接种人或非人动物的方法，所述方法包括向需要这种疫苗接种的对象给药有效量的本文中所描述的组合物。第三方面，本专利技术涉及一种生产本文中所描述的SAPN的方法，所述方法包括：i)向包含核酸衍生物的缓冲液添加SAPN，和ii)使用常规的重折叠流程在所述核酸衍生物存在下重折叠所述SAPN。附图说明图1：包封CpG的纳米粒子的单体的示意图。下面是所述单体的构件：·X1是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列。·ND1是形成m个亚基ND1的寡聚物(ND1)m的卷曲螺旋，·L1是具有+3的总正电荷的肽连接物，·ND2是形成n个亚基ND2的寡聚物(ND2)n的卷曲螺旋，·Y1不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列。图2：DEDDLI-RR的分子模型。A)带有相应激动剂的TLR5和TLR9受体的X-射线晶体结构：TLR5二聚体与两个鞭毛蛋白分子(黄色和洋红色)相互作用，而TLR9与CpG相互作用。B)左侧：自组装蛋白的单体构件，由his标签(X1)、五聚卷曲螺旋(ND1)、二聚卷曲螺旋(ND2)和鞭毛蛋白的D0和D1结构域(X2)构成。所述两个卷曲螺旋寡聚化结构域ND1和ND2通过具有三个正电荷的连接物(L1)联结。右侧：CpG分子。C)组装的蛋白质纳米粒子，其具有60个蛋白质链和包封在中央空腔中的约36个CpG分子。为更清晰起见，圆圈内部的蛋白质链(代表正电荷)未示出，以使粒子内(带负电荷的)CpG分子可见。注意，图A)、B)和C)中不是所有的结构都按尺寸绘制。图3：pPEP-T的载体图谱。“prom”：启动子；“term”：终止子；“ori”：原点；“bp”：碱基对；“amp”：氨苄青霉素抗性基因。图4：构建物DEDDLI-RR的SDS-PAGE。该构建物具有44.8kDa的理论分子量。A)两种不同浓度的下述样品的表达水平UI–未诱导的I–诱导的B)来自于FPLC的洗脱曲线。蛋白质用12本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在对象中诱导免疫应答的组合物，其包含：/n(a)由多个下式(I)的构件构成的自组装蛋白纳米粒子(SAPN)：/nX1–ND1–L1–ND2–Y1 (I)，/n所述式(I)的构件由包含卷曲螺旋寡聚化结构域ND1、连接物L1、卷曲螺旋寡聚化结构域ND2和其他取代基X1和Y1的连续链构成，其中/nND1是包含m个亚基ND1的寡聚物(ND1)

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170223 EP 17157687.91.一种用于在对象中诱导免疫应答的组合物，其包含：
(a)由多个下式(I)的构件构成的自组装蛋白纳米粒子(SAPN)：
X1–ND1–L1–ND2–Y1(I)，
所述式(I)的构件由包含卷曲螺旋寡聚化结构域ND1、连接物L1、卷曲螺旋寡聚化结构域ND2和其他取代基X1和Y1的连续链构成，其中
ND1是包含m个亚基ND1的寡聚物(ND1)m的卷曲螺旋寡聚化结构域，
ND2是包含n个亚基ND2的寡聚物(ND2)n的卷曲螺旋寡聚化结构域，
m和n各自为2至10之间的数字，前提是m不等于n并且不是n的倍数，并且n不是m的倍数，
L1是在生理条件下具有至少+2的总正电荷的肽连接物，
X1不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，
Y1不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，
其中所述多个式(I)的构件任选地与多个下式(II)的构件共同组装：
X2–ND3–L2–ND4–Y2(II)
所述式(II)的构件由包含卷曲螺旋寡聚化结构域ND3、连接物L2、卷曲螺旋寡聚化结构域ND4和其他取代基X2和Y2的连续链构成，其中
ND3是包含y个亚基ND3的寡聚物(ND3)y的卷曲螺旋寡聚化结构域，
ND4是包含z个亚基ND4的寡聚物(ND4)z的卷曲螺旋寡聚化结构域，
y和z各自为2至10之间的数字，前提是y不等于z并且不是z的倍数，并且z不是y的倍数，并且其中
ND3与ND1一致，或者ND4与ND2一致，或者ND3和ND4两者分别与ND1和ND2一致，
L2是在生理条件下具有至少+2的总正电荷的肽连接物，X2不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，
Y2不存在，或者是包含可以被进一步取代的1至1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，
(b)免疫刺激性物质，其中所述免疫刺激性物质是核酸衍生物，其中所述核酸衍生物被包封在所述SAPN中。


2.根据权利要求1的组合物，其中所述肽连接物L1和/或肽连接物L2彼此独立地由至少4个氨基酸构成，并且在生理条件下具有至少+3的总正电荷。


3.根据权利要求1的组合物，其中所述肽连接物L1和/或肽连接物L2彼此独立地包含选自SEQIDNO：4中所示的氨基酸序列、SEQIDNO：12中所示的氨基酸序列、SEQIDNO：14中所示的氨基酸序列和SEQIDNO：15中所示的氨基酸序列的氨基酸序列。


4.根据权利要求1至3任一项的组合物，其中所述核酸衍生物选自含有胞嘧啶紧随其后是鸟嘌呤的单链DNA、来自于RNA病毒的单链RNA、来自于RNA病毒的双链RNA和来自于RNA病毒的模拟双链RNA的聚合复合物，其中所述胞嘧啶核苷酸是未甲基化的。


5.根据权利要求1至3任一项的组合物，其中所述核酸衍生物是选自A类CpGODN、B类CpGODN和C类ODN的CpG寡脱氧核苷酸(CpGODN)。


6.根据权利要求1至3任一项的组合物，其中所述核酸衍生物是选自如SEQIDNO：13、SEQIDNO：39、SEQIDNO：42、SEQIDNO：43、SEQIDNO：44、SEQIDNO：45、SEQIDNO：46、SEQIDNO：47、SEQIDNO：48和SEQIDNO：49所示的核苷酸序列的CpG寡脱氧核苷酸(CpGODN)。


7.根据权利要求1至6任一项的组合物，其中所述核酸衍生物通过离子相互作用结合到所述SAPN。


8.根据权利要求1至7任一项的组合物，其中所述由多个式(I)的构件构成的SAPN的蛋白质链与所述核酸衍生物的摩尔比为约1至约0.6。


9.根据权利要求1至8任一项的组合物，其中ND1和/或ND3或ND2和/或ND4中的任一者是选自五聚卷曲螺旋、四聚卷曲螺旋、三聚卷曲螺旋和二聚卷曲螺旋的卷曲螺旋。


10.根据权利要求1至9任一项的组合物，其中ND1和/或ND3或ND2和/或ND4中的任一者是选自4PN8、4PND、4WBA、3V2N、3V2P、3V2Q、3V2R、4EEB、4EED、3MIW、1MZ9、1FBM、1VDF、2GUV、2HYN、1ZLL和1T8Z的五聚卷曲螺旋，或者其中ND1和/或ND3或ND2和/或ND4中的任一者是选自4PN8、4PND、4WBA、3V2N、3V2P、3V2Q、3V2R、4EEB、4EED、3MIW、1MZ9、1FBM、1VDF、2GUV、2HYN、1ZLL和1T8Z的五聚卷曲螺旋，其含有氨基酸修饰和/或在任一或两个末端处缩短，其中每个卷曲螺旋按照RCSB蛋白质数据库(RCSBPDB)的pdb编目号指示。


11.根据权利要求1至9任一项的组合物，其中ND1和/或ND3或ND2和/或ND4中的任一者是选自5D60、5D5Y、5AL6、4WB4、4BHV、4C5Q、4GJW、4H7R、4H8F、4BXT、4LTO、4LTP、4LTQ、4LTR、3ZDO、3RQA、3R4A、3R4H、3TSI、3K4T、3F6N、2O6N、2OVC、2O1J、2O1K、2AG3、2CCE、1YBK、1U9F、1U9G、1U9H、1USD、1USE、1UNT、1UNU、1UNV、1UNW、1UNX、1UNY、1UNZ、1UO0、1UO1、1UO2、1UO3、1UO4、1UO5、1W5I、1W5L、1FE6、1G1I、1G1J、1EZJ、1RH4和1GCL的四聚卷曲螺旋，或者其中ND1和/或ND3或ND2和/或ND4中的任一者是选自5D60、5D5Y、5AL6、4WB4、4BHV、4C5Q、4GJW、4H7R、4H8F、4BXT、4LTO、4LTP、4LTQ、4LTR、3ZDO、3RQA、3R4A、3R4H、3TSI、3K4T、3F6N、2O6N、2OVC、2O1J、2O1K、2AG3、2CCE、1YBK、1U9F、1U9G、1U9H、1USD、1USE、1UNT、1UNU、1UNV、1UNW、1UNX、1UNY、1UNZ、1UO0、1UO1、1UO2、1UO3、1UO4、1UO5、1W5I、1W5L、1FE6、1G1I、1G1J、1EZJ、1RH4和1GCL的四聚卷曲螺旋，其含有氨基酸修饰和/或在任一或两个末端处缩短，其中每个卷曲螺旋按照RCSB蛋白质数据库(RCSBPDB)的pdb编目号指示。


12.根据权利要求1至9任一项的组合物，其中ND1和/或ND3或ND2和/或ND4中的任一者是选自5TOH、5TOI、5K92、5KB0、5KB1、5KB2、5KKV、5EFM、2N64、5ABS、5IEA、5APP、5APQ、5APS、5APY、5APZ、5D5Z、4YPC、4YV3、4CGB、4CGC、4CJD、4R0R、4UW0、4P67、4OXM、3W8V、3W92、3W93、4I2L、4K8U、4JBZ、3VTQ、4L1R、4JDO、4J4A、4E52、3VYI、3ZMF、3VU5、3VU6、2YNY、2YNZ、2YO0、2YO1、2YO2、4G1A、4GIF、3TQ2、4DZK、4DZL、4DZN、3TE3、3R48、3SWF、3SWY、3PR7、2YKO、2YKP、2YKQ、3NTN、3PP5、3MKO、3MGN、3NWA、3NWD、3NWF、3L35、3L36、3L37、3M9B、3M9D、2X6P、3LJM、3AHA、3H7X、3H7Z、3LT6、3LT7、3GJP、2KP8、3KPE、2WPR、2WPS、2WPY、2WPZ、2WQ0、2WQ1、2WQ2、2WQ3、3HFC、3HFE、3HRN、3HRO、3H5F、3H5G、2WG5、2WG6、2W6B、2JJL、2VRS、3EFG、3DUZ、2OT5、2Z2T、2QIH、3BK6、2O7H、2R32、2JGO、2Q7C、2Q3I、2Q5U、2IBL、1ZV8、1ZVB、2FXP、1WT6、2AKF、1TGG、1SLQ、1S9Z、1PW9、1PWB、1M7L、1GZL、1KYC、1KFM、1KFN、1IJ0、1IJ1、1IJ2、1IJ3、1HQJ、1QU1、1B08、1CZQ、1CUN、1SVF、1CE0、1PIQ、1AQ5、1AVY、1HTN、1AA0、1ZIJ、1ZIM、1COI、1SWI、1GCM和1HUP的三聚卷曲螺旋，或者其中ND1和/或ND3或ND2和/或ND4中的任一者是选自5TOH、5TOI、5K92、5KB0、5KB1、5KB2、5KKV、5EFM、2N64、5ABS、5IEA、5APP、5APQ、5APS、5APY、5APZ、5D5Z、4Y...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡罗琳·库兰加拉，萨拉·玛丽亚·保罗，马特奥·普拉扎，森蒂尔·库马尔·拉曼，彼得·布克哈德，
申请(专利权)人：阿尔法O肽股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH