一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法技术

本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，公开了一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条及其制备方法，所述胶体金试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫，所述结合垫上包被有金标探针，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线固定有捕获探针，所述质控线固定有质控探针；本发明专利技术同时公开了一种采用上述胶体金试纸条检测石斑鱼虹彩病毒的方法。本发明专利技术的胶体金试纸条基于核酸适配体结合侧流生物传感器以及胶体金显色的原理制成，具有较高的特异性和灵敏度，组装简单，便于携带，检测方法操作简便，可以对石斑鱼虹彩病毒进行高效、准确、快速的现场实时检测。

A colloidal gold strip for the detection of grouper iridovirus and its preparation and detection

【技术实现步骤摘要】
一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法
本专利技术涉及病毒检测
，更具体的，涉及一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法。
技术介绍
近年来，在石斑鱼等海水养殖动物中暴发和流行的虹彩病毒严重地威胁着水产养殖业的发展。虹彩病毒在全球范围内已发现和鉴定出60多种，基于虹彩病毒的宿主范围和全基因组测序信息，虹彩病毒被划分为五个属，分别为虹彩病毒属、蛙虹彩病毒属、绿虹彩病毒属、肿大细胞病毒属和淋巴囊肿病毒属。2003年，科研人员等从养殖的患病石斑鱼体中分离出了一种虹彩病毒，其具有高致病性，对石斑鱼具有90％以上的致死率，显微镜下发现该病毒粒子的结构是正二十面体，大部分聚集在宿主胞质中。其粒子中心为一类核体，周围包被外壳，进而被囊膜包裹，大小在200nm左右。对该种虹彩病毒进行分析后发现其与蛙虹彩病毒属的一个成员具有较近的亲缘关系，被认定为蛙虹彩病毒属的一个新种，以新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)命名。SGIV的频繁爆发给水产养殖业带来了巨大的经济损失，但是目前仍无有效的方法来治疗SGIV感染，因此，建立有效的诊断方法来早期检测和预防这种病毒性疾病是非常必要的，然而传统的SGIV检测方法如聚合酶链式反应法或电镜观察法耗时且需利用专业的仪器设备，所以也很难满足实时检测的要求。综上所述，研发一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法实为必要。
技术实现思路
本专利技术提供的一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法，解决了现有的石斑鱼虹彩病毒检测方法费时费力，检测条件要求高以及检测程序复杂，不能在现场进行实时检测的问题。本专利技术的胶体金试纸条及检测方法基于核酸适配体结合侧流生物传感器以及胶体金显色的原理，具有较高的灵敏度和特异性，制备组装简单，便于携带，检测方法简单，操作方便，可以对石斑鱼虹彩病毒进行高效、准确、快速的检测。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫，所述结合垫上包被有金标探针，所述金标探针为5’端巯基修饰的核酸适配体，其核苷酸序列为：5’-SH-TATGTCCATGGCCGCATATT(序列1)；所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线固定有捕获探针，所述质控线固定有质控探针：所述捕获探针的核苷酸序列为：TTTGGACTATGTGGAAGTT(序列2)；所述质控探针的核苷酸序列为：AATATGCGGCCATGGACATA(序列3)。本专利技术还公开了所述检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：S1.制备样品垫；S2.制备结合垫，并在结合垫上包被金标探针；S3.硝酸纤维素膜的处理：采用三维划膜喷金仪将捕获探针和质控探针以0.5-0.8μL/cm的喷样量在硝酸纤维素膜上划线得到检测线和质控线，所述检测线和质控线之间的距离为5～6mm；S4.胶体金试纸条的组装：将所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次固定在所述底板上，各相邻的部件相互重叠2～3mm，然后将其整体切成4mm宽，避光密闭环境下保存备用。进一步的，所述步骤S1具体为：将玻璃纤维置于含有0.5％的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、2％蔗糖、1％BSA、50mM硼酸，pH8.0的溶液中浸泡后，室温干燥12h制成。进一步的，所述步骤S2具体包括以下步骤：a.胶体金(AuNP)的合成：取200ml浓度为0.01％的HAuCl4溶液置于500ml圆底烧瓶中，轻轻搅拌并加热至沸腾，快速加入8ml浓度为1％的柠檬酸三钠，溶液颜色先变为深蓝色，再变为葡萄酒红色，继续沸腾5min，保持温和搅拌；停止加热，15min后移至磁力搅拌器，搅拌冷却至室温，得到AuNP溶液；b.胶体金-核酸适配体(AuNP-DNA)复合物的制备：将步骤①所得AuNP溶液进行10倍浓缩，取400μl浓缩液加入金标探针，于4℃下轻轻摇晃12h，然后加入浓度为10％的牛血清白蛋白(BSA)，反应4h，得到胶体金-核酸适配体(AuNP-DNA)复合物；在所述复合物中添加浓度为1％的十二烷基硫酸钠至其在体系中终浓度为0.01％，再加入浓度为1.5mol/L的NaCl溶液使体系中盐离子终浓度为150mM，所得复合溶液置于4℃反应12h；c.将步骤b所得的复合溶液以12000rpm的转速离心10～20min，并用缓冲液清洗三次，去除多余的未结合DNA，丢弃上清，将所得红色颗粒重新悬浮在150μl的缓冲液中，得到胶体金-核酸适配体(AuNP-DNA)结合溶液，于4℃保存；d.取步骤c所得的胶体金-核酸适配体结合溶液以每条2-3μl的量滴加在所述结合垫上，室温风干5min，即得包被有金标探针的结合垫。进一步的，所述步骤c中的缓冲液为含有20mMNa3PO4、5％BSA、0.25％吐温以及10％蔗糖的溶液。本专利技术同时公开了一种采用上述胶体金试纸条检测石斑鱼虹彩病毒的检测方法，该检测方法包括以下步骤：①病毒孵育：取100μl磷酸盐缓冲液(PBS)，加入捕获适配体(Aptamer1)和扩增适配体(Aptamer2)，使所述捕获适配体(Aptamer1)和扩增适配体(Aptamer2)的浓度分别达到200nM，再加入石斑鱼虹彩病毒(SGIV)感染的细胞孵育10～15min，得到含石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的混合物；②链置换反应：将2μl经链霉亲和素(SA)修饰的磁珠加入所述混合物中，振荡10～15min，得到Aptamer1-SGIV-Aptamer2-磁珠复合物，用磁器分离架将Aptamer1-SGIV-Aptamer2-磁珠复合物收集，用含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤三次，将复合物转移到离心管中进行链置换反应(SDA)，反应温度为37℃，时间为30min，得到SDA反应产物；③取样检测：取步骤②的SDA反应产物3～4滴至胶体金试纸条的样品垫上，反应5min，观察胶体金试纸条显色结果；④结果判读：阳性反应：胶体金试纸条的检测线、质控线均显色；阴性反应：胶体金试纸条的检测线不显色，质控线显色。进一步的，所述步骤②中的链置换反应(SDA)反应体系中，按体积量计，包括：SDA引物2μl、脱氧核苷三磷酸酯(dNTPs)2μl、聚合酶(Klenowfragmentexo)0.6μl、切刻内切酶(Nt.BbvCI)0.4μl、SDA-buffer-22μl、10％BSA1μl、超纯水12μl。进一步的，所述SDA引物的核苷酸序列为：GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG(序列7)。进一步的，所述捕获适配体(Aptamer1)和扩增适配体(Aptamer2)的制备方法为：①筛选病毒的核酸适配体：采用磁珠法SELEX技术，筛选得到石斑鱼虹彩病毒(简称SGIV)的核酸适配体，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫，其特征在于，/n所述结合垫上包被有金标探针，所述金标探针为5’端巯基修饰的核酸适配体，其核苷酸序列为：5’-SH-TATGTCCATGGCCGCATATT；/n所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线固定有捕获探针，所述质控线固定有质控探针：/n所述捕获探针的核苷酸序列为：TTTGGACTATGTGGAAGTT；/n所述质控探针的核苷酸序列为：AATATGCGGCCATGGACATA。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫，其特征在于，
所述结合垫上包被有金标探针，所述金标探针为5’端巯基修饰的核酸适配体，其核苷酸序列为：5’-SH-TATGTCCATGGCCGCATATT；
所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线固定有捕获探针，所述质控线固定有质控探针：
所述捕获探针的核苷酸序列为：TTTGGACTATGTGGAAGTT；
所述质控探针的核苷酸序列为：AATATGCGGCCATGGACATA。


2.根据权利要求1所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.制备样品垫；
S2.制备结合垫，在结合垫上包被金标探针；
S3.硝酸纤维素膜的处理：采用喷金仪将捕获探针和质控探针以0.5-0.8μL/cm的喷样量在硝酸纤维素膜上划线得到检测线和质控线，所述检测线和质控线之间的距离为5～6mm；
S4.胶体金试纸条的组装：将所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次固定在所述底板上，各相邻的部件相互重叠2～3mm，然后将其整体切成4mm宽，避光保存。


3.根据权利要求2所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述S1具体为：将玻璃纤维置于含有0.5％TritonX-100、2％蔗糖、1％牛血清白蛋白(BSA)、50mM硼酸，pH8.0的溶液中浸泡后，室温干燥12h制成。


4.根据权利要求2所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述S2具体包括以下步骤：
a.胶体金的合成：取200ml浓度为0.01％的HAuCl4溶液搅拌并加热至沸腾，加入8ml浓度为1％的柠檬酸三钠，待溶液变为葡萄酒红色，继续沸腾5min，停止加热，搅拌冷却至室温，得到胶体金溶液；
b.胶体金-核酸适配体复合物的制备：将步骤①所得胶体金溶液进行10倍浓缩，取400μl浓缩液加入金标探针，于4℃摇晃12h；然后加入浓度为10％的BSA，反应4h，得到胶体金-核酸适配体复合物；
在所述复合物中添加1％的十二烷基硫酸钠至其终浓度为0.01％，再加入浓度为1.5mol/L的NaCl溶液使盐离子终浓度为150mM，所得复合溶液置于4℃反应12h；
c.将步骤b所得的复合溶液以12000rpm的转速离心10～20min，并用缓冲液清洗三次，丢弃上清，将所得颗粒重悬在150μl的缓冲液中，得到胶体金-核酸适配体结合溶液，于4℃保存；
d.取步骤c所得的胶体金-核酸适配体结合溶液2～3μl滴加在所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦启伟，刘嘉昕，王劭雯，曾令文，李趁，俞也频，魏世娜，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44