检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒，属于水产病原生物检测试剂技术领域。本发明专利技术检测对虾肝肠胞虫的引物组，根据SEQ ID No:1所示核酸序列的第76～279位、第240～439位或479～671位核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。用本发明专利技术引物组检测对虾肝肠胞虫，不仅克服了现有技术中对大型昂贵仪器依赖、检测操作复杂的问题；而且，本发明专利技术引物组的检测灵敏度高、特异性好，适用于水产养殖场等简陋条件的快速测定。

Primer set for detection of hepatoenterocystis prawn and kit containing the primer set

【技术实现步骤摘要】
检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒
本专利技术属于水产病原生物检测试剂
，具体涉及一种检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒。
技术介绍
近年来，随着养虾业的再次兴旺，对虾养殖规模不断扩大，但由于对虾病害严重，给对虾养殖业造成了较大的经济损失。对虾肝肠胞虫病(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)是对虾养殖中危害严重的病害之一。目前，EHP已在中国多个对虾养殖区被检出，且检出率有增加的趋势。肝肠胞虫属于微孢子虫科、肠胞虫属，是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫。成熟的孢子呈椭圆形，长度0.75-1μm，后端有一个空泡，胞内含一个细胞核，5-6个极丝圈，1个与极丝相连的锚盘，和1层电子致密的孢子壁。我国最早于2013年在养殖的凡纳滨对虾中检出了EHP的感染，并且检测样品中具有很高的阳性检出率；对虾虾肝肠胞虫寄生发病率约为25％，导致养殖产量减少15-20％，在全年较少发生白斑综合症的情况下，EHP的感染产生的经济损失达3亿元。EHP感染可导致虾免疫力降低，继而由水体中的条件致病菌引起继发感染，出现肠炎、组织坏死、红体等多种病症。EHP可以直接通过养殖水体在对虾中直接水平传播，即通过虾传播，虾经口摄食寄生EHP的死虾/病虾、鲜活饵料或环境中的孢子体而感染。孢子可在养殖环境中累积，从而导致疫情的传播。隐孢子虫在世界上的分布非常广，是一种体积微小的球虫类寄生虫，众多脊椎动物都有隐孢子虫。但目前EHP感染还没有有效的防治药物，而EHP比一般的微孢子虫小，且不形成肉眼可见的胞囊，且感染EHP的对虾不表现出明显的疾病症状，摄食正常，肠胃充满食物，不出现大批死亡。因此，需要在实验室采用组织学或分子生物学方法确诊。也就是说苗种产地检疫工作中进行该病原的定性或定量检测，对于该病的预防具有重要意义。通常采用PCR方法检测对虾肝肠胞虫，虽然灵敏度高，但对仪器的要求严格，易出现假阳性。随着分子生物学的发展，新型PCR检测方法不断涌现，例如，专利文件201510287845.8提供了一种套式引物用于养殖对虾虾肝肠胞虫感染早期预警，其主要是基于两对引物进行PCR扩增，虽然该套式引物检测灵敏度很高且特异性好，但是，其检测过程仍需依赖PCR仪，检测过程也需要专门仪器。专利文件201610429433.8公开了一种引物组配合使用的探针采用TaqMan实时荧光定量PCR检测虾肝肠胞虫，其检测方法虽比普通PCR的灵敏度高，而且免去了电泳等复杂的操作，但是其检测设备仍需依赖荧光定量PCR仪。专利201710538284.3提供一种南美白对虾肝肠胞虫LAMP检测的方法，降低了肝肠胞虫检测对大型昂贵仪器的依赖，简化了常规PCR检测繁琐的操作流程；但是，其染料选择羟基萘酚蓝，可通过肉眼辨别接测结果为紫罗兰色或天兰色来判别检测结果的阴性或阳性；然而相对于目标物拷贝数少的样品则难以区分颜色差别；而且现有LAMP等温扩增技术由于假阳性较高，准确度低，水产病原检测中的应用比较局限。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒，用本专利技术引物组检测对虾肝肠胞虫，不仅克服了现有技术中对大型昂贵仪器依赖、检测操作复杂的问题；而且，本专利技术引物组的检测灵敏度高、特异性好，适用于水产养殖场等简陋条件的快速测定。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：检测对虾肝肠胞虫的引物组，根据SEQIDNo:1所示核酸序列的第76～279位、第240～439位或479～671位核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。在上述方案的基础上，所述引物组序列为：F3：5’-TGAGTAGAAGGGTCGAGTGTA-3’；B3：5’-ACCATGCTCCCTATCCGT-3’；FIP：5’-AGTTGGAATTACCGCGGCTGCACCTTGACGTGAAGCAATTGG-3’；BIP：5’-TGCAGTTAAAGGGTCCGTAGTCGTCCGCTACTCTCAACAAACTC-3’；LF：5’-TGGCACCAAAACTTGCCCT-3’；或F3：5’-TGAGTTTGTTGAGAGTAGCGG-3’；B3：5’-CCCAGCATTGTCGGCATAG-3’；FIP：5’-GCTTTCGCCTCCGTTGGTCCGAGCATGGTATAGGTGGGC-3’；BIP：5’-GACGTATCTGGGGATCAAGGACGGCTAGAACTACAGCGGTGTC-3’；LF：5’-AGGTGGGGTCTTGAGATTTCATTC-3’；LB：5’-AAGGCTAGAGTATCGAAAGTGATT-3’；或F3：5’-TTTCGGGCTCTGGGGATA-3’；B3：5’-TCGCCCCATCAATTTCCAAC-3’；FIP：5’-AGCACAATCCACTCCTGGTAGTGGCTCGCAAGGGTGAAACT-3’；BIP：5’-TCAACGCGGGAAAACTTACCAGGGCACCACTCTTGTCTACCTC-3’；LF：5’-TCCTTCCGTCAATTTCGCTTT-3’。上述引物组在制备对虾肝肠胞虫检测试剂中的应用。一种对虾肝肠胞虫的检测试剂盒，包含上述的至少一组引物组。在上述方案的基础上，所述对虾肝肠胞虫的检测试剂盒，还包含反应缓冲液、BstDNA聚合酶、逆转录酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。在上述方案的基础上，所述的阳性对照为含有SEQIDNo:1所示核酸序列的T克隆载体。本专利技术的有益效果：本专利技术应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermamplification，LAMP)，根据对虾肝肠胞虫基因中的一段序列SEQIDNo:1，采用PrimerExploerV4软件设计3套LAMP特异性引物组合，分别记为EHP-1、EHP-2、EHP-3，每套引物分别包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和环引物(LF和/或LB)。通过筛选，最终确定将EHP-1和EHP-3用于检测对虾肝肠胞虫，并对其特异性和灵敏度进行验证，结果显示，EHP-1和EHP-3对水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、阴性核酸、副溶血弧菌、对虾虹彩病毒、镰刀真菌均无非特异性扩增，EHP-1和EHP-3最低检测含量为83-27copies/μL。本专利技术应用LAMP法可以从分子水平上直接、快速、准确的检测对虾肝肠胞虫，并具有如下优点：1、操作简单：在恒温热水浴即可完成操作，不需要对模板进行热变性处理，节省了因温度循环而消耗的时间，对仪器依赖性小；2、反应迅速：在10～20min即可完成反应；3、特异性强：本专利技术的引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测对虾肝肠胞虫的引物组，其特征在于，根据SEQ ID No:1所示核酸序列的第76～279位、第240～439位或479～671位核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。/n

【技术特征摘要】
1.检测对虾肝肠胞虫的引物组，其特征在于，根据SEQIDNo:1所示核酸序列的第76～279位、第240～439位或479～671位核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。


2.根据权利要求1所述检测对虾肝肠胞虫的引物组，其特征在于，所述引物组序列为：
F3：5’-TGAGTAGAAGGGTCGAGTGTA-3’；
B3：5’-ACCATGCTCCCTATCCGT-3’；
FIP：5’-AGTTGGAATTACCGCGGCTGCACCTTGACGTGAAGCAATTGG-3’；
BIP：5’-TGCAGTTAAAGGGTCCGTAGTCGTCCGCTACTCTCAACAAACTC-3’；
LF：5’-TGGCACCAAAACTTGCCCT-3’；
或
F3：5’-TGAGTTTGTTGAGAGTAGCGG-3’；
B3：5’-CCCAGCATTGTCGGCATAG-3’；
FIP：5’-GCTTTCGCCTCCGTTGGTCCGAGCATGGTATAGGTGGGC-3’；
BIP：5’-GACGTATCTGGGGATCAAGGACGGCTAGAACTACAGCGGTGTC-3’；
LF：5’-AG...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛辉，林克冰，周宸，杨章武，林琪，
申请(专利权)人：福建省水产研究所福建水产病害防治中心，
类型：发明
国别省市：福建;35