CRISPR-Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及CRISPR‑Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用。本发明专利技术具体涉及一种提高CRISPR‑Cas9敲除原代T细胞基因的效率的方法，所述方法包括向T细胞递送Cas9mRNA和化学修饰的sgRNA。该方法可应用于各种CAR‑T细胞、TCR‑T细胞、TIL细胞的制备。

Crispr-cas9 efficient knockout of primary T cell gene and its application

【技术实现步骤摘要】
CRISPR-Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用
本专利技术涉及细胞治疗领域，特别涉及CRISPR-Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用。
技术介绍
基因编辑T细胞的应用(1)通用型CAR-T细胞治疗嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗技术是通过体外转导一个识别癌细胞的人工基因于人体T细胞上，使人T细胞具有特异杀伤肿瘤细胞的能力。CAR-T细胞治疗属于过继性免疫疗法(adoptivecelltransfer,ACT)，它利用人体免疫细胞来对抗肿瘤，被称为“活体药物”。基因编辑在CAR-T细胞治疗中是一个非常热门的领域，究其原因在于CAR-T细胞治疗是一个非常具有潜力的抗癌疗法，已经在多种白血病治疗中取得了巨大成功。另外一点是基因编辑技术使得CAR-T细胞治疗具有更多的可变性。基因编辑CAR-T细胞本质上是一种在体外操作的基因疗法，不需要面对复杂困难的递送方式，更有可行性。目前基因编辑CAR-T细胞主要应用于通用型CAR-T细胞治疗上，具体应用有以下几点：a.TCR基因敲除，避免GvHD，从而可用于异体移植。移植物抗宿主反应(graftversushostdisease，GVHD)是由移植物中的特异性淋巴细胞识别宿主抗原而发生的一种反应。其产生的条件是移植物中包含T淋巴细胞及移植物与宿主的主要组织相容性抗原不一致。在骨髓移植中，GvHD是主要的障碍，其会杀伤宿主体内的细胞而导致多器官功能衰竭，进而引起其它并发症。在通用型CAR-T细胞治疗中，GvHD是最需要避免的一个问题，否则宿主有严重的副作用。TCR是T淋巴细胞识别靶细胞主要基因，敲除TCR基因可以避免异体T细胞对宿主细胞的攻击，所以异体移植的通用型CAR-T细胞必须将TCR基因敲除才能避免GvHD。通常只需要将TCR-α或TCR-β其中之一敲除就可以使TCR蛋白不展示在T细胞表面。b.B2M、CIITA基因敲除，避免受体T细胞攻击，降低排异反应。不同的个体，其组织相容性抗原存在差异，从而导致了受体T细胞对移植物的攻击和排异。为解决这个问题，通常利用基因编辑的方法(如ZFN、TALEN或CRISPR-Cas9)将CAR-T细胞中的B2M基因敲除，从而使HLA-ABC蛋白无法在细胞表面展示，进而可以避免被受体T细胞攻击。也有一些研究者将CIITA基因一并敲除，来降低二类组织相容性抗原的表达。c.PD-1、CTLA-4、LAG-3等免疫检查点基因敲除，提高通用型CAR-T疗效。PD-1、CTLA-4等免疫检查点是近年已经被证明非常有效的肿瘤免疫靶点，通过这些免疫检查点抗体来封闭肿瘤浸润T细胞(TIL细胞)从而激活已经“疲惫不堪”的TIL细胞。已经有临床研究证明直接体外敲除TIL细胞的PD-1基因可以激活TIL细胞并有效缓解肿瘤进展，也有研究证明敲除PD-1可以增强CAR-T细胞的体内和体外抗肿瘤疗效。(2)艾滋病领域基因编辑T细胞在艾滋病治疗领域研究较早，从ZFN基因编辑工具开始就已经开始尝试编辑T细胞基因组DNA。艾滋病病毒非常特异的侵染CD4T细胞，理论上通过编辑CD4T细胞有治疗艾滋病的潜力。其具体应用是：a.CCR-5基因敲除，防止HIV病毒侵染CD4T细胞。CCR-5是表达于T细胞表面的一个受体蛋白，著名的“柏林病人”布朗正是移植CCR-5基因缺陷的骨髓才彻底治愈艾滋病。CCR-5在T细胞或者干细胞中敲除是艾滋病治疗非常前沿的一个方向。(3)TCR-T领域TCR是T细胞受体(Tcellreceptor)的缩写。在普通的T细胞上，这些受体能特异性地识别癌细胞表面或内部的靶点。在TCR-T疗法中，研发人员分离出内源性TCR，并加以工程化改造，将其引入全新的T细胞，并输注回人体。TCR-T疗法在一些实体瘤中表现出了治疗的潜力，基因编辑应用于TCR-T细胞疗法主要有：a.TCR双链同时敲除，避免外源性TCR与内源性TCR错配。TCR-T细胞制作过程中外源性TCR容易与内源性TCR蛋白形成异二聚体，这种二聚体并不能识别目的肿瘤抗原，甚至会识别正常的细胞抗原而引起严重的副作用。不同于通用CAR-T中只需要敲除一个TCR链(TCR-α或TCR-β)，TCR-T细胞需要将TCR双链同时敲除才能起到好的治疗效果，因为内源性TCR-α或TCR-β都可能与外源性TCR-β或TCR-α结合。b.PD-1、CTLA-4、LAG-3等免疫检查点基因敲除，提高TCR-T细胞治疗疗效。原理和基因编辑通用型CAR-T一样。细胞基因敲除方法(a)ZFN锌指核酸酶(Zinc-fingernuclease,ZFN)又名锌指蛋白核酸酶(ZFPN)，它是一类人工合成的限制性内切酶，由锌指DNA结合域(zincfingerDNA-bindingdomain)与限制性内切酶的DNA切割域(DNAcleavagedomain)融合而成。研究者可以通过加工改造ZFN的锌指DNA结合域，靶向定位于不同的DNA序列，从而使得ZFN可以结合复杂基因组中的目的序列，并由DNA切割域进行特异性切割。此外，通过将锌指核酸酶技术和胞内DNA修复机制结合起来，研究者还可以自如地在生物体内对基因组进行编辑。目前，在大量植物、果蝇、斑马鱼、蛙、大/小鼠及牛等物种中，ZFN技术已被广泛应用于靶向基因的突变，通过人工修改基因组信息可以产生遗传背景被修改的新物种。该技术在医学领域也具有非常重大的价值，对于疾病的基因治疗有潜在意义，具有非常广泛的应用前景。(2)TALEN近年又发现了另外一种简单的DNA识别模块，那就是TALE核酸酶中的DNA识别模块。TALE蛋白是一种源自植物致病菌—黄单包杆菌(Xanthomonas)的天然蛋白，其中也含有DNA结合结构域。TALE蛋白中的DNA结合结构域是由一连串33～35个氨基酸组成的重复结构域组成的，其中每一个结构域都能够识别一个碱基。TALE核酸酶的DNA结合特异性主要由两个高度可变的氨基酸决定，科学家们将这两个关键的氨基酸称作重复可变双氨基酸残基位点(repeat-variabledi-residues,RVD)。与锌指结构域一样，这种TALE重复模块也能够串联起来，识别一长串的DNA序列。但是克隆这么一大段TALE蛋白DNA序列识别结构域的重复编码序列也是一个不小的挑战。为了解决这个问题，科学家们也想出了不少的办法，现在就已经有好几种方案能够让科研人员快速地组装出任意搭配的TALE蛋白DNA序列识别结构域。有多个使用了各种组装策略的大规模的、系统性研究项目表明，TALE重复识别模块可以组装在一起，识别任何DNA序列。自2010年正式专利技术TALEN技术以来，全球范围内多个研究小组利用体外培养细胞、酵母、拟南芥、水稻、果蝇及斑马鱼等多个动植物体系验证了TALEN的特异性切割活性。(3)CRISPR-Cas9CRISPR(ClustersofRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)技术在2012年由麻省理工学院本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高CRISPR-Cas9敲除原代T细胞基因的效率的方法，所述方法包括向T细胞递送Cas9mRNA和化学修饰的sgRNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高CRISPR-Cas9敲除原代T细胞基因的效率的方法，所述方法包括向T细胞递送Cas9mRNA和化学修饰的sgRNA。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述化学修饰的sgRNA在头尾1-10个碱基具有(i)甲基化修饰；(ii)磷酸化修饰；和/或(iii)能够稳定sgRNA的其它修饰。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述甲基化修饰为2’-O-甲基化修饰，并且所述磷酸化修饰为3’硫代磷酸化修饰。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas9类型包括：SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9和cpf1，优选SpCas9，其氨基酸序列如SEQIDNO:1。


5.根据权利要求1所述方法，其中Cas9mRNA采用如下方法获得：将Cas9基因克隆至质粒载体后，PCR扩增出5’端带有T7或SP6启动子的Cas9DNA片段，并体外转录为Cas9mRNA。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述Cas9mRNA含有入核信号，所述入核信号优选SV40NLS和核质蛋白NLS，其氨基酸序列分别为SEQIDNO:2和SEQIDNO:3。


7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中靶向TRAC基因的sgRNA包含SEQIDNO:4的DNA序列，靶向B2M基因的sgRNA包含SEQIDNO:5的DNA序列。


8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，所述方法还包括激活T细胞，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭作翰，李玏，
申请(专利权)人：西安桑尼赛尔生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61