一种高活力乳糖酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种编码乳糖酶的人工合成基因，该基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片：1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；或3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。按照本发明专利技术所述的基因序列进一步构建重组载体并转化酵母，可实现该重组乳糖酶在甲醇诱导下的分泌表达，通过镍亲和纯化，可得到纯度高于95％活性重组乳糖蛋白，该活性蛋白具有很强的水解乳糖活性，将为分解乳制品中的乳糖提供高活力的酶产品。

Preparation and application of a high activity lactase gene and its recombinant protein

【技术实现步骤摘要】
一种高活力乳糖酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用
本专利技术属于生物分子克隆
，涉及一种高活力乳糖酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用。
技术介绍
乳糖不耐受是由于乳糖酶分泌少，不能完全消化分解母乳或牛乳中的乳糖所引起的非感染性腹泻，又称乳糖酶缺乏症。母乳和牛乳中的糖类主要是乳糖，小肠尤其是空肠黏膜表面绒毛的顶端乳糖酶的分泌量减少或活性不高就不能完全消化和分解乳汁中乳糖，部分乳糖被结肠菌群酵解成乳酸、氢气、甲烷和二氧化碳。乳酸刺激肠壁，增加肠蠕动而出现腹泻，偶尔还可能诱发肠痉挛出现肠绞痛。乳糖酶缺乏是广泛存在的世界性问题，不同国家乳糖不耐受发生的高峰年龄段不同，我国87％的儿童乳糖不耐受发生在7～8岁。利用外源基因表达系统来生产重组乳糖酶是大量获得乳糖酶的主要技术手段之一。大肠杆菌的遗传背景清楚，又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特点，成为外源基因的首选表达系统。不少研究者将外源基因构建大肠杆菌表达载体，经转化E.coli在BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过体外合适的条件下溶解、变性、复性、纯化，从每升培养基可得到仅能得到几十至上百微克的的可溶性蛋白质。在大肠杆菌中表达，可能因为LPS的存在而产生毒副作用，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定。最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活，因此该表达系统并不适合于大量生产重组乳糖酶。昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等外源基因表达系统对技术、设备和技术水平的要求太高，因此生产的产品往往价格都很高，同样不适合乳糖酶的大量且低成本地生产。甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统，以Pichiapastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还具最显著的优点：通过筛选高水平分泌表达的转化子和优化表达条件，可以廉价且大规模地生产和制备重组蛋白。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术目的在于提供一种高活力乳糖酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.本专利技术提供基因，为编码乳糖酶蛋白的基因，为如下(1)-(2)中任意一种的DNA分子：(1)由序列表中SEQIDNo.1所示的DNA分子；(2)与SEQIDNO.1所示核苷酸序列或至少具有90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；其中，序列表中的SEQIDNo.1由1638个脱氧核苷酸组成，本序列包括乳糖酶基因的成熟蛋白全长读码框和6个组氨组成的表达标签和终止密码子，编码具有序列表中SEQIDNo.2的氨基酸残基序列的蛋白质。由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本专利技术的保护范围。2.本专利技术提供蛋白，是如下(1)或(2)：(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的由序列2衍生的蛋白质。其中，序列表中的序列2由546个氨基酸残基组成，其中前540个氨基酸残基为成熟乳糖酶蛋白氨基酸序列，后6个氨基酸残基为组氨酸组成的表达标签，其编码基因的读码框包含1638个核苷酸(包含一个终止密码子)。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。3.含有上述基因的重组载体、表达盒或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pPICZαA的XhoI和XbaI酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNo.3(GCCTCGAGAAAAGAAAAAAGCAATCCGCTACTACAAC)，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNo.4(GCTCTAGATCAGTTGATGATAGTAGTGTCAC)，利用SEQIDNo.3和SEQIDNo.4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。4.本专利技术的第四个目的是提供一种制备乳糖酶蛋白的方法，包括以下步骤：S1：将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZαA分别用XhoI和XbaI双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16℃连接，得重组载体pPICZαA-乳糖酶；S2：将所述重组载体pPICZαA-乳糖酶用SacI单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；S3：将所述阳性克隆转接至含有1000μg/mLZeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10mlBMGY培养液的50毫升离心管培养高抗性的转化子，28℃、250rpm培养至OD600＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，将上清液10μl加入到100μl浓度为5mmol/L硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷溶液中，4℃下反应30min后，加入100μl浓度为2mol/L的碳酸钠，终止反应。取30μl上述反应终止液，加入到含有70μlpH6.0的20mM的磷酸二氢钠溶液的96孔酶标板中，于400nm测定吸光值。吸光值较大的转化子即为高水平表达乳糖酶的转化子，吸光值最大的转化子即为最高水平表达乳糖酶的转化子。S4：将高水平分泌表达乳糖酶的转化子用BMGY大量生长培养，之后用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养，用于大量分泌乳糖酶重组蛋白，并补加甲醇使其质量分数保持在1～2％。进一步，将所述高表达乳糖酶的转化子用1L的BMGY培养基扩大培养至OD600为10～15，离心所得菌体用100ml的BMMY培养基重悬后，诱导培养用于大量分泌乳糖酶重组蛋白，诱导培养的条件是：28℃、250rpm、每隔24小时向离心管中加入1ml的甲醇，共诱导3-4天。BMGY扩大生长培养后，一般以生长培养基1/10-1/5体积的诱导培养基BMMY来诱导培养。优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：S5：将所述S4发酵后的培养液离心，取上清液利用Tris碱调节pH至8，以大于或等于15000g的转速离心30分钟，将获得的上清液加入到经pH8Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用2～4倍层析柱体积的pH8的含10mMTris-HCl和30mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；S6：用含10mMTris-HCl和200mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高活力乳糖酶基因，其特征在于，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：/n1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；/n2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或至少具有90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；/n3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种高活力乳糖酶基因，其特征在于，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：
1)序列表中SEQIDNO.1的核苷酸序列；
2)与SEQIDNO.1所示核苷酸序列或至少具有90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；
3)与SEQIDNO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的基因编码得到的乳糖酶。


3.根据权利要求2所述的乳糖酶，其特征在于：所述乳糖酶为如下(1)或(2)的蛋白：
(1)蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示；
(2)序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有乳糖酶活性的由SEQIDNO.2衍生的蛋白质。


4.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒或重组菌。


5.根据权利要求4所述的重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的基因。


6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为pPICZα载体。

【专利技术属性】
技术研发人员：李洪波，董海丽，胡兴，
申请(专利权)人：怀化学院，
类型：发明
国别省市：湖南;43