基于流体力学的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法技术

一种基于流体力学的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，通过改变搅拌桨及操作条件，来改善茂源链霉菌细胞培养环境的剪切力、供氧和混合环境，通过流体力学条件的调控使链霉菌的细胞生长和代谢处于有利于的方法来提高谷氨酰胺转氨酶合成，从而提高其的发酵产量。通过提升氧传质速率系数、控制剪切力在较低水平，为发酵罐提供了较佳的细胞培养环境，从而提升微生物表达TG酶的水平、提高其发酵产量，在40立方米工业规模发酵罐、发酵26小时的酶活达47.9U/mL，为至今吨级规模发酵罐的最高报道水平，产生良好经济效益。

Optimization of glutamine transaminase fermentation based on hydrodynamics

【技术实现步骤摘要】
基于流体力学的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法
本专利技术涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种改善发酵体系的流体力学环境来增强谷氨酰胺转氨酶发酵产量的方法。
技术介绍
茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶(TG酶)(蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺转移酶，EC2.3.2.13，Microbialtransglutaminase)作为新型蛋白食品的食品添加剂，能催化蛋白质肽健中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基和伯胺之间的酰胺基的转移反应，使得蛋白质发生交联。生产谷氨酰胺转氨酶普遍存在着发酵产酶低、酶活不稳定等多种问题，现有技术一般通过挑选高产的菌种、优化培养基成分、添加适当的诱导因子来促进发酵、优化发酵条件等能够提升摇瓶与小罐规模的一定发酵水平，但如何提高TG酶在大罐规模的发酵生产水平，涉及发酵过程放大的关键因子，由于该链霉菌生理代谢的复杂性以及菌丝体的剪切敏感性，一直是学术界和工业界关注的研发课题。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于流体力学的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，通过改变搅拌桨及操作条件，来改善细胞培养环境的剪切力、供氧和混合环境，通过流体力学条件的调控使链霉菌的细胞生长和代谢处于有利于的方法来提高谷氨酰胺转氨酶合成，从而提高其发酵产量。通过提升氧传质速率系数(kLa)、控制剪切力在较低水平，为发酵罐提供了较佳的细胞培养环境，从而提升微生物表达TG酶的水平、提高其发酵产量。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术包括以下步骤：步骤1)挑取斜面培养的孢子进行恒温的种子培养；所述的种子培养，采用内含液体种子培养基的摇瓶或发酵罐，在24-30℃环境下实现。所述的种子培养具体为：挑取斜面培养的孢子至容积250mL且内含30-50mL液体种子培养基的摇瓶中，24-30℃恒温摇瓶培养，摇床转速100-250rpm，培养20-32h，用于10立升发酵罐的发酵；或者是挑取斜面培养的孢子至容积为4000L且内含2800L液体种子培养基的发酵罐中(内径140cm、内深350cm)，24-30℃恒温培养，设置发酵罐中的搅拌器为三层抛物线型搅拌桨(直径45cm、桨间距90cm，最底层桨距罐底25-45cm)，搅拌转速40-120rpm，通气量8-100m3/h，培养20-38h得到菌体。所述的孢子来自一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌(Streptoverticilliummobaraense)菌株(YRZ170817NTG31)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC15353，保藏日期为2018.2.12。所述的液体种子培养基的组分为(g/L)：甘油20-30、鱼粉蛋白胨20-35、酵母粉3-10、玉米浆0-5、MgSO4·7H2O1-3、K2HPO4·3H2O1-5，该液体种子培养基的pH为7.4，优选经121℃环境下灭菌20min。步骤2)将种子培养液接种于具有搅拌器的发酵罐中进行量产培养；所述的量产培养，采用内径19cm、内深35.3cm的10立升发酵罐或内径280cm、内深650cm的40立方米发酵罐，在30-37℃环境下实现。所述的量产培养具体为：采用250mL步骤1中得到的种子培养液，在无菌条件下按5-15％接种量接入装有5.8立升发酵培养基的10立升发酵罐进行发酵，该发酵罐内设有六叶平翼桨、六斜叶桨、抛物线型桨、四翼桨或其组合的搅拌器；或者是采用4000L步骤1中得到的种子培养液，在无菌条件下按5-15％接种量接入装有28立方米发酵培养基的40立方米发酵罐；该发酵罐内设有抛物线型桨、四翼桨或其组合的搅拌器。所述的搅拌器在量产培养过程中全程使用，当采用10立升发酵罐时，通气量为0.1-3.0vvm，搅拌转速在50-700rpm，搅拌器的结构的直径为发酵罐内径的1/3-1/2，采用距离罐底6-12cm的单层桨布置或下部的搅拌桨距离罐底2-4cm，两桨之间的距离5-9cm的双层桨布置；当发酵过程中溶氧低于5％时，调节通气量和搅拌转速，使整个发酵过程中溶氧维持在5％以上，发酵共持续了24-36h；当采用40立方米发酵罐时，通气量为70-800m3/h，搅拌转速在40-200rpm，搅拌器的的直径为发酵罐内径的1/3-1/2，采用下部的搅拌桨距离罐底50-90cm，两桨之间的距离100-160cm的三层或四层桨布置。当发酵过程中溶氧低于1％时，调节通气量和搅拌转速，发酵时长22-32小时。所述的发酵培养基的组分为(g/L)：甘油20-50、鱼粉水解液50-150、酵母粉5-10、玉米浆5-20、MgSO4·7H2O1-5、K2HPO4·3H2O1-10、(NH4)2SO41-10、Na2SO31-10、促进剂5-20，余量为水；该发酵培养基的pH为7.4，优选经121℃环境下灭菌20-40min。上述促进剂为：磷酸镁与磷酸氢镁的混合物，其质量比为(1:1)-(1:5)。技术效果与现有技术相比，本专利技术在使发酵罐内的剪切力比较低的情况下，显著改善了发酵罐的供氧能力和径向混合状态；由此产生的技术效果包括：(1)本专利技术采用调控发酵液的流体力学环境条件的方法，在实验室发酵罐和工业生产罐中，显著提高了TG酶的产量，所提出的策略简便实用，产生了经济效益。(2)本专利技术通过采用不同的搅拌桨及操作条件，发现在发酵中后期需要较高的氧供应有利于产酶，而转速增大引起的剪切力会损伤菌丝体，采用四翼桨可以较好地达到混合供氧与剪切力的平衡，具有一定的优势，即：在四翼桨发酵罐的培养中，在发酵中后期提升转速，这是调控TG酶生产的一种有效方法，不仅节省发酵成本，也有利于精准调控。附图说明图1为实施例采用六平翼桨的10立升发酵罐进行TG酶发酵的a)细胞量(PVC)及b)酶活(以OD525表示)变化的动态曲线示意图；图2为实施例采用不同组合桨的10立升发酵罐中测得的kLa值；图3为实施例工业生产罐中采用四翼桨测得的kLa值；图4为实施例在工业发酵罐的茂源链霉菌培养产TG酶活的动态变化。具体实施方式实施例1本实施例采用10立升、内径19cm、内深35.3cm的发酵罐进行TG酶发酵，发酵罐内设置的搅拌桨的直径为7.5-8.6cm，采用双层六平翼桨结构，其中下部的搅拌桨距离罐底4cm，两桨之间的距离8-9cm，具体步骤如下：①于洁净工作台中，将在固体培养基上活化好的细菌接种于30mL液体种子液培养基中，24-30℃条件下振荡培养20-32h，得到一级种子液；②按照5-15％的接种量接种于上述10立升发酵罐，该发酵罐内预装5.8L液体发酵培养基，发酵温度30℃，起始转速为300rpm、通气量为1vvm(kLa＝125/h)，其中kLa值是据动态法-氮气排空法测得。当发酵过程中溶氧低于10％时，通气量升到1.5vvm(kLa＝135/h)，当发酵过程中溶氧再次低于10％时，#2、#3、#4发酵罐的搅拌转速分别提升到400rpm(k本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于流体力学的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征在于，包括：挑取斜面培养的孢子进行恒温的种子培养，再将种子培养液接种于具有搅拌器的发酵罐中进行量产培养得以实现；/n所述的孢子来自一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌(Streptoverticilliummobaraense)菌株(YRZ170817NTG31)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC15353，保藏日期为2018.2.12；/n所述的搅拌器为六叶平翼桨、六斜叶桨、抛物线型桨、四翼桨或其组合的搅拌器。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于流体力学的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征在于，包括：挑取斜面培养的孢子进行恒温的种子培养，再将种子培养液接种于具有搅拌器的发酵罐中进行量产培养得以实现；
所述的孢子来自一种高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌(Streptoverticilliummobaraense)菌株(YRZ170817NTG31)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC15353，保藏日期为2018.2.12；
所述的搅拌器为六叶平翼桨、六斜叶桨、抛物线型桨、四翼桨或其组合的搅拌器。


2.根据权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征是，所述的种子培养，采用内含液体种子培养基的摇瓶或发酵罐，在24-30℃环境下实现。


3.根据权利要求1或2所述的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征是，所述的种子培养具体为：挑取斜面培养的孢子至容积250mL且内含30-50mL液体种子培养基的摇瓶中，24-30℃恒温摇瓶培养，摇床转速100-250rpm，培养20-32h，用于10立升发酵罐的发酵；或者是挑取斜面培养的孢子至容积为4000L且内含2800L液体种子培养基的发酵罐中，24-30℃恒温培养，设置发酵罐中的搅拌器为三层抛物线型搅拌桨，搅拌转速40-120rpm，通气量8-100m3/h，培养20-38h得到菌体；
所述的4000L发酵罐为内径140cm、内深350cm；
所述的抛物线型搅拌桨为直径45cm、桨间距90cm，最底层桨距罐底25-45cm。


4.根据权利要求1或2所述的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征是，所述的液体种子培养基的组分为(g/L)：甘油20-30、鱼粉蛋白胨20-35、酵母粉3-10、玉米浆0-5、MgSO4·7H2O1-3、K2HPO4·3H2O1-5。


5.根据权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶优化发酵方法，其特征是，所述的量产培养，采用内径19cm、内深35.3cm的10立升发酵罐或内径280cm、内深65...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟建江，马胜超，步国建，
申请(专利权)人：泰兴市东圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32