CRISPR-Cas9高效敲入嵌合抗原受体基因到T细胞特定基因组位点的方法及应用技术

本发明专利技术涉及CRISPR‑Cas9高效敲入嵌合抗原受体基因到T细胞特定基因组位点的方法及其应用。本发明专利技术具体涉及一种将CAR基因精确敲入到T细胞目的基因组DNA的方法，所述方法包括a)采用基因编辑物质剪切目的基因组DNA，其中所述目的基因组DNA位于基因启动子区后，起始密码子和其所处的外显子3端之间；b)将CAR基因克隆至修复模版载体后导入T细胞，细胞以同源重组方式修复被剪切的目的基因组DNA，从而将CAR基因嵌入，其中所述修复模版载体为腺相关病毒载体。该方法可应用于各种CAR‑T细胞制备。

Crispr-cas9: a method and application of efficiently typing chimeric antigen receptor gene into specific genomic site of T cell

【技术实现步骤摘要】
CRISPR-Cas9高效敲入嵌合抗原受体基因到T细胞特定基因组位点的方法及应用
本专利技术涉及细胞治疗领域，特别涉及CRISPR-Cas9高效敲入嵌合抗原受体基因到T细胞特定基因组位点的方法及其应用。
技术介绍
CAR-T治疗传统肿瘤治疗药物包括化疗药、靶向药，虽然它们在一定程度上提高了癌症患者的生存期，但同时也带来了严重的副作用，极大地降低了病人的生存质量。更不幸的是，大部分患者在接受这些传统治疗后仍旧会复发，而一旦复发，无药可救是大概率事件。近年来,随着免疫治疗的发展，免疫检验点抑制剂药物(如：CTLA-4、PD-1/PD-L1抗体)的出现，彻底改变了肿瘤治疗的方式。但这类药物在不同癌症病人中的有效率只有20％-40％，仍然有大部分的癌症患者等待新的有效治疗方式的出现。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗技术是通过体外转导一个识别癌细胞的人工基因于人体T细胞上，使人T细胞具有特异杀伤肿瘤细胞的能力。CAR-T细胞治疗属于过继性免疫疗法(adoptivecelltransfer,ACT)，它利用人体免疫细胞来对抗肿瘤，被称为“活体药物”。这种ACT疗法在近年已应用于临床实验当中，特别是在儿童白血病方面的有效探索，为研究者以及医生开辟了一条治疗肿瘤的新路径。2017年末，两款CAR-T药物获得美国FDA的许可上市，然而，这种ACT疗法仍旧处于其早期阶段。它与传统药物相比具有如下创新点：首先，精确靶向肿瘤，且副作用可逆。CAR-T细胞治疗相比化疗药、靶向药具有更特异的肿瘤细胞杀伤能力。在输入病人体内后，虽然短时间内会产生细胞因子效应，但该副反应可控，病人在获得完全缓解的情况下基本上能和健康人一样生活。其次，持续缓解时间长。CAR-T细胞部分属于记忆T细胞，在输入病人体内后能长期存在于病人身体中，时刻监视身体中是否出现肿瘤细胞，一旦有新的肿瘤细胞出现就会立刻将其杀灭。CAR转导方式本领域通常涉及以下CAR转导方式：1)慢病毒或者逆转录病毒慢病毒或逆转录病毒可用于包装3kb以下的目的DNA序列，其优势在于：a.较高的感染效率，通常转染后阳性率可以达到50％左右；b.病毒分泌到培养基中较多，浓缩纯化相对容易；c.T淋巴细胞感染病毒后能保持一个良好的细胞状态，存活和扩增不易受到影响，有利于后续回输给病人。其不足之处在于：a.随机插入细胞基因组中，容易导致产生的CAR-T细胞耗竭及潜在的癌变风险；b.感染T细胞后，残留的病毒有强免疫原性。2)转座子转座子优势在于简单的生产工艺流程，无病毒残留的风险。但由于编码转座子的载体为质粒DNA，其在电穿孔入T细胞后有细胞毒性作用，不利于产生的CAR-T细胞扩增。同样，转座子介导也是随机性地将CAR基因插入到T细胞基因组中。3)mRNAmRNA编码的CAR基因转导T细胞依赖于电穿孔，其优势在于只短暂地表达目的蛋白于T细胞中(大约表达7天)，对于前期不确定是否存在严重副作用的CAR-T细胞，这种方法能够相对安全的进行人体实验。但其缺点也很明显，就是不能持久的表达，作用时间相对有限。CRISPR-Cas9技术CRISPR(ClustersofRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)技术在2012年由麻省理工学院和加州大学伯克利分校的科学家共同发现，是一种由RNA序列介导的双链DNA内切酶工具。其由两个部分构成，其中之一是100bp左右的sgRNA，用于靶向识别目的双链DNA，另一部分是1369个氨基酸的Cas9蛋白，其可结合sgRNA，并且具有DNA酶活性，人为设计的sgRNA和Cas9蛋白形成复合体后可对目的DNA进行特异性切割，当切割造成错配修复，则导致基因移码而起到敲除目的，当添加一段修复DNA序列，则会进行有目的的编辑。自CRISPR-Cas9技术问世至今，已经在很多个领域得到应用。基因敲入技术虽然基因敲除技术取得了长足发展，但是对于大片段基因敲入效率一直不高。基因敲入和基因敲除区别在于是否添加一个修复模版。其过程是：在核酸酶对特定DNA进行剪切后，修复模版根据同源重组原理对“损伤”DNA进行修复，在修复后将特定DNA片段引入特定位点。目前使用的修复模版主要有质粒DNA，双链DNA和单链DNA，在这其中，有研究显示单链DNA效率相对最高。在原代T细胞中，大片段的基因敲入更是难上加难，研究显示，以上不同形式的修复模版做基因敲入，其效率不超过5％，并且质粒DNA和双链DNA都具有不同程度的细胞毒性，并不适合在T细胞中做基因敲入的修复模版。所以原代T细胞的基因敲入仍需要新的有效方法出现。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术首先提供：本专利技术的第一个方面，提供一种将CAR基因精确敲入到T细胞目的基因组DNA的方法，所述方法包括一：a)采用基因编辑物质剪切目的基因组DNA，其中所述目的基因组DNA位于基因启动子区后，起始密码子和其所处的外显子3端之间；b)将CAR基因克隆至修复模版载体后导入T细胞，细胞以同源重组方式修复被剪切的目的基因组DNA，从而将CAR基因嵌入，其中所述修复模版载体为腺相关病毒载体。或二：a)将CAR基因克隆至修复模版载体后导入T细胞；b)采用基因编辑物质剪切目的基因组DNA，其中所述目的基因组DNA位于基因启动子区后，起始密码子和其所处的外显子3端之间；c)细胞以同源重组方式修复被剪切的目的基因组DNA，从而将CAR基因嵌入，其中所述修复模版载体为腺相关病毒载体。本专利技术的第二个方面，提供根据第一个方面所述的方法，其中所述基因编辑物质包括CRISPR-Cas9、ZFN、TALEN和megaTAL。本专利技术的第三个方面，提供根据第一个方面所述的方法，其中CAR基因敲入的目的基因组DNA位点包括TRAC、TRBC、HIF-1、PD-1启动子调控区域。本专利技术的第四个方面，提供根据第二个方面所述的方法，其中所述基因编辑物质为CRISPR-Cas9，其中所述Cas9类型包括：SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9和cpf1，优选SpCas9，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术的第五个方面，提供根据第四个方面所述的方法，其中采用(i)SpCas9蛋白和sgRNA、(ii)SpCas9表达质粒和sgRNA表达质粒、和/或(iii)SpCas9mRNA和修饰的sgRNA递送方式剪切目的基因组DNA，其中sgRNA修饰方式为：5’和3’端1-10个碱基进行(i)2’-O-甲基化修饰；(ii)2’-O-甲基化和3’硫代磷酸化修饰；或(iii)能够稳定sgRNA的其它修饰。本专利技术的第六个方面，提供根据第一个方面所述的方法，其中所述腺相关病毒载体包含左右同源臂和敲入基因。本专利技术的第七个方面，提供根据第六个方面所述的方法，其中敲入的基因从5’端到3’端包括：剪切肽基因、C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将CAR基因精确敲入到T细胞目的基因组DNA的方法，所述方法包括一：/na)采用基因编辑物质剪切目的基因组DNA，其中所述目的基因组DNA位于基因启动子区后，起始密码子和其所处的外显子3端之间；/nb)将CAR基因克隆至修复模版载体后导入T细胞，细胞以同源重组方式修复被剪切的目的基因组DNA，从而将CAR基因嵌入，其中所述修复模版载体为腺相关病毒载体。/n或二：/na)将CAR基因克隆至修复模版载体后导入T细胞；/nb)采用基因编辑物质剪切目的基因组DNA，其中所述目的基因组DNA位于基因启动子区后，起始密码子和其所处的外显子3端之间；/nc)细胞以同源重组方式修复被剪切的目的基因组DNA，从而将CAR基因嵌入，其中所述修复模版载体为腺相关病毒载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种将CAR基因精确敲入到T细胞目的基因组DNA的方法，所述方法包括一：
a)采用基因编辑物质剪切目的基因组DNA，其中所述目的基因组DNA位于基因启动子区后，起始密码子和其所处的外显子3端之间；
b)将CAR基因克隆至修复模版载体后导入T细胞，细胞以同源重组方式修复被剪切的目的基因组DNA，从而将CAR基因嵌入，其中所述修复模版载体为腺相关病毒载体。
或二：
a)将CAR基因克隆至修复模版载体后导入T细胞；
b)采用基因编辑物质剪切目的基因组DNA，其中所述目的基因组DNA位于基因启动子区后，起始密码子和其所处的外显子3端之间；
c)细胞以同源重组方式修复被剪切的目的基因组DNA，从而将CAR基因嵌入，其中所述修复模版载体为腺相关病毒载体。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑物质包括CRISPR-Cas9、ZFN、TALEN和megaTAL。


3.根据权利要求1所述的方法，其中CAR基因敲入的目的基因组DNA位点包括TRAC、TRBC、HIF-1、PD-1启动子调控区域。


4.根据权利要求2所述的方法，其中所述基因编辑物质为CRISPR-Cas9，其中所述Cas9类型包括：SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9和cpf1，优选SpCas9，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


5.根据权利要求4所述的方法，其中采用(i)SpCas9蛋白和sgRNA、(ii)SpCas9表达质粒和sgRNA表达质粒、和/或(iii)SpCas9mRNA和修饰的sgRNA递送方式剪切目的基因组DNA，其中sgRNA修饰方式为：5’和3’端1-10个碱基进行(i)2’-O-甲基化修饰；(ii)2’-O-甲基化和3’硫代磷酸化修饰；或(iii)能够稳定sgRNA的其它修饰。


6.根据权利要求1所述的方法，其中所述腺相关病毒载体包含左右同源臂和敲入基因。


7.根据权利要求6所述的方法，其中敲入的基因从5’端到3’端包括：剪切肽基因、CAR基因、PolyA基因，其中剪切肽优选是T2A、P2A和IRES，其DNA序列分别如SEQIDNO:2-4所示；PolyA优选包括BGHpA，其DNA序列如SEQIDNO:5所示；CAR基因优选包含信号肽DNA、抗体scFvDNA、铰链区DNA、跨膜区DNA、一个或两个共刺激信号区DNA和信号传导区DNA。


8.根据权利要求7所述的方法，其中CAR的跨膜区选自以下蛋白：CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD1。


9.根据权利要求7所述的方法，其中CAR的跨膜结构选自CD8，其氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。


10.根据权利要求7所述的方法，其中CAR的铰链结构选自以下蛋白：IgG1、IgG4、IgD和CD8所示。


11.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭作翰，李玏，
申请(专利权)人：西安桑尼赛尔生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61