氨氧化古菌及淡水池塘的氨氧化古菌富集培养方法技术

本发明专利技术提供了一种淡水池塘的氨氧化古菌富集培养方法，该方法包括富集培养和分离纯化的步骤；本发明专利技术的氨氧化古菌从淡水池塘中提取，富集培养过程中利用氨氧化古菌富集培养基中的尿素作为氮源，在加热过程中不会挥发，且在水溶液中状态稳定，经高温处理仍然会保持初始浓度值，所以可以直接高温灭菌，从而减少了培养过程中杂菌污染的机会；本发明专利技术的富集培养过程中利用氨氧化古菌富集培养基中的碳酸钙作为附着基质，其不仅相对比表面积较大，供氨氧化古菌附着生长，减少更换培养基过程微生物损失，且可缓冲、稳定培养基的pH值在7.0附近，从而利于氨氧化古菌稳定生长；另外，碳酸钙还可以提供无机碳源碳酸根离子，供生命体使用。

【技术实现步骤摘要】
氨氧化古菌及淡水池塘的氨氧化古菌富集培养方法
本专利技术属于水产养殖环境微生物
，具体涉及一种氨氧化古菌及淡水池塘的氨氧化古菌富集培养方法。
技术介绍
在过去的100多年时间里，人们一直认为氨氮的氧化完全由氨氧化细菌执行，但最近10年，氨氧化古菌的发现彻底改变了这一认识。古菌又称古细菌、古生菌或太古生物、古核生物，是单细胞微生物，是完全不同于细菌的另外一个生物分类的域，或一个界。它们与细菌有很多相似之处，都没有细胞核与任何其它膜结合细胞器，同时另一些特征相似于真核生物，比如存在重复序列与核小体。由于古菌对实验室培养条件要求苛刻，目前，世界上获取的古菌菌株和培养物非常少。淡水池塘每年能为中国提供50％以上的水产品，氨氧化古菌对于池塘环境中的氨氮转化发挥重要作用。因此，富集、分离池塘环境氨氧化古菌具有重要意义。公开号为CN104593304A公开了一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法，即从海洋水体中获取氨氧化古菌，其培养物过程需要添加三羧酸循环代谢产物。公开号为CN109652568A公开了一种从环境中快速富集Nitrosocosmicus属氨氧化古菌的方法，即从土壤生境获取氨氧化古菌，其培养过程不需要添加任何有机物质。由此说明，不同生境中的氨氧化古菌生活习性差异甚远。淡水池塘是完全不同于海洋和土壤的生态系统，其受人为因素干扰较大，在养殖季节，淡水池塘每天都接受大量饲料，水体和沉积物中的有机质与氨氮浓度远远高于海洋，且池塘水体受光照干扰较为强烈，目前已有海洋和土壤生境培养方法对于池塘生境氨氧化古菌的培养可能不适用。并且，目前已有氨氧化古菌培养方法往往以氯化铵作为培养基氮源，铵盐在溶液中以NH3-N和NH4+-N两种物质状态存在，其比例会随溶液pH降低的而降低，随pH的升高而升高，较高浓度的NH3-N和极低浓度的NH3-N都不利于氨氧化古菌生长。在培养过程中由于不断有质子消耗，培养基pH往往会随时间的推移而降低，进而导致了培养基溶液中NH3-N浓度的不确定性，氨氧化古菌生长速率不稳定。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中的不足，本专利技术的目的是提供一种淡水池塘的氨氧化古菌富集培养方法。为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：一种淡水池塘的氨氧化古菌富集培养方法，其包括如下步骤：(1)、在氨氧化古菌富集培养基中接种样品，在36±1℃下进行第一阶段的富集培养；(2)、当步骤(1)中氨氧化古菌富集培养基中的尿素耗尽时，取100±10μL的氨氧化古菌富集培养物置于新鲜的氨氧化古菌富集培养基中，并分别添加50±1mg/L的青霉素和链霉素，进行第二阶段的富集培养；(3)、当步骤(2)中氨氧化古菌富集培养基中的尿素耗尽时，倒掉上清液，保留底部的碳酸钙，然后往里面补充新鲜无菌的氨氧化古菌富集培养基，并分别添加50±1mg/L的青霉素和链霉素，在36±1℃下静置培养；(4)、重复操作步骤(3)5-6次，提取氨氧化古菌富集培养基中的微生物总DNA，并对16SrDNA进行PCR扩增，对PCR扩增的产物进行深度测序，鉴定样品中的微生物多样性。其中，氨氧化古菌富集培养基为：每L富集培养基包含0.2±0.01mmolCO(NH2)2、1±0.1mmolKH2PO4、1±0.1mmolKCl、0.2±0.01mmolMgSO4、10±1mmolNaCl、40±1mmolCaCO3、1±0.1mL微量元素和1±0.1mL硒钨溶液；微量元素为：每L溶液包含0.2±0.01mmolMnSO4、1±0.1mmolH3BO3、0.5±0.01mmolZnCl2、0.3±0.01mmolNa2MoO4·2H2O、0.1±0.01mmolCuCl2、0.1±0.01mmolNiCl2、0.5±0.01mmolCoCl2、3.5±0.01mmolFeSO4·7H2O和2.5mL37％HCl；硒钨溶液为：每L溶液包含12.5±0.01mmolNaOH、10±1μmolNa2SeO3和10±1μmolNa2WO4。优选地，步骤(1)中，样品为淡水池塘沉积物。优选地，氨氧化古菌富集培养基中碳酸钙的比表面积为1±0.1m2/g，粒径为0.5-3μm。优选地，步骤(4)中，16SrDNA进行PCR扩增的引物为：338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。一种氨氧化古菌，其由上述的氨氧化古菌富集培养方法得到。由于采用上述方案，本专利技术的有益效果是：第一、本专利技术的氨氧化古菌从淡水池塘中提取，富集培养过程中利用氨氧化古菌富集培养基中的尿素作为氮源，在加热过程中不会挥发，且在水溶液中状态稳定，经高温处理仍然会保持初始浓度值，所以可以直接高温灭菌，从而减少了培养过程中杂菌污染的机会，其操作简便、实用。第二、本专利技术的富集培养过程中利用氨氧化古菌富集培养基中的碳酸钙作为附着基质，其不仅相对比表面积较大，供氨氧化古菌附着生长，减少更换培养基过程微生物损失，且可缓冲、稳定培养基的pH值在7.0附近，从而利于氨氧化古菌稳定生长；另外，碳酸钙还可以提供无机碳源中的碳酸根离子，供生命体使用。第三、本专利技术的富集培养过程中使用青霉素和链霉素能够抑制和杀死培养基中的绝大部分杂菌，但氨氧化古菌生长并不会受到抑制，从而使得氨氧化古菌的纯度达到85％以上。第四、本专利技术的富集培养过程中采用梯度稀释法，不仅可缩短富集和筛选的周期，且使得氨氧化古菌的丰度得到提高，经扩大培养后，可用于控制水产养殖水体的氨氮浓度，具有很大的应用价值。附图说明图1为本专利技术的氨氧化古菌在种水平上的结果示意图。图2为本专利技术的氨氧化古菌在属水平上的结果示意图。图3为本专利技术的氨氧化古菌在门水平上的结果示意图。具体实施方式本专利技术提供了一种淡水池塘的氨氧化古菌富集培养方法。本专利技术的淡水池塘的氨氧化古菌富集培养方法包括如下步骤：(1)、配制氨氧化古菌富集培养基，量取100mL该培养基于蓝盖瓶(容量100mL)中，在121℃下灭菌，持续15min，冷却后接种0.5g池塘沉积物，在36±1℃下的培养箱内静置培养1个月；(2)、培养期间，每7天检测一次氨氧化古菌富集培养基中的水质指标，包括亚硝酸盐和硝酸盐的浓度。通过计算，当步骤(1)中氨氧化古菌富集培养基中的尿素耗尽时，摇动并混匀该培养基，取100±10μL的氨氧化古菌富集培养物置于新鲜的氨氧化古菌富集培养基中，并分别添加50±1mg/L的青霉素和链霉素，进行第二阶段的富集培养；(3)、当步骤(2)中氨氧化古菌富集培养基中的尿素耗尽时，倒掉上清液，保留底部的碳酸钙，然后往里面补充新鲜无菌的氨氧化古菌富集培养基，并分别添加50±1mg/L的青霉素和链霉素，置于36±1℃下继续静置培养；(4)、重复操作步骤(3)5-6次，提取氨氧化古菌富集培养基中的微生物总DNA，并用引物(338F：ACTCCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种淡水池塘的氨氧化古菌富集培养方法，其特征在于：其包括如下步骤：/n(1)、在氨氧化古菌富集培养基中接种样品，在36±1℃下进行第一阶段的富集培养；/n(2)、当步骤(1)中所述氨氧化古菌富集培养基中的尿素耗尽时，取100±10μL的氨氧化古菌富集培养物置于新鲜的氨氧化古菌富集培养基中，并分别添加50±1mg/L的青霉素和链霉素，进行第二阶段的富集培养；/n(3)、当步骤(2)中所述氨氧化古菌富集培养基中的尿素耗尽时，倒掉上清液，保留底部的碳酸钙，然后补充新鲜的氨氧化古菌富集培养基，并分别添加50±1mg/L的青霉素和链霉素，在36±1℃下静置培养；/n(4)、重复操作步骤(3)5-6次，提取氨氧化古菌富集培养基中的微生物总DNA，并对16SrDNA进行PCR扩增，鉴定样品中的微生物多样性；/n所述氨氧化古菌富集培养基为：每L富集培养基包含0.2±0.01mmolCO(NH

【技术特征摘要】
1.一种淡水池塘的氨氧化古菌富集培养方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)、在氨氧化古菌富集培养基中接种样品，在36±1℃下进行第一阶段的富集培养；
(2)、当步骤(1)中所述氨氧化古菌富集培养基中的尿素耗尽时，取100±10μL的氨氧化古菌富集培养物置于新鲜的氨氧化古菌富集培养基中，并分别添加50±1mg/L的青霉素和链霉素，进行第二阶段的富集培养；
(3)、当步骤(2)中所述氨氧化古菌富集培养基中的尿素耗尽时，倒掉上清液，保留底部的碳酸钙，然后补充新鲜的氨氧化古菌富集培养基，并分别添加50±1mg/L的青霉素和链霉素，在36±1℃下静置培养；
(4)、重复操作步骤(3)5-6次，提取氨氧化古菌富集培养基中的微生物总DNA，并对16SrDNA进行PCR扩增，鉴定样品中的微生物多样性；
所述氨氧化古菌富集培养基为：每L富集培养基包含0.2±0.01mmolCO(NH2)2、1±0.1mmolKH2PO4、1±0.1mmolKCl、0.2±0.01mmolMgSO4、10±1mmolNaCl、40±1mmolCaCO3、1±0.1mL微量元素和1±0.1mL硒钨溶液；
所述微量元素为：每L溶液包含0.2±0.01mmolMnSO4、1±0.1mmolH...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆诗敏，刘翀，刘兴国，周润锋，沈泓烨，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31