一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌及其活菌制剂与应用制造技术

本发明专利技术公开了一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌及其活菌制剂与应用。一株分离自盐碱地白菜根际土壤的太平洋芽孢杆菌(Bacillus pacificus)YJJK‑16，2019年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18300。该菌株的发酵液加入没食子酸丙酯、生化黄腐酸粉和卡松搅拌均匀，得到活菌制剂。太平洋芽孢杆菌YJJK‑16耐盐碱能力较强，在盐碱土壤中定植率高，对白菜软腐病病原菌具有较强的拮抗作用，可用于生产微生物肥料，特别是盐碱地白菜专用微生物肥料，用于白菜软腐病的生物防治，减少病害发生，提高产量和质量。

A salt tolerant Bacillus Pacific and its active preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌及其活菌制剂与应用
本专利技术涉及一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌及其在防治白菜软腐病方面的应用，属于农业生物

技术介绍
白菜也称黄芽菜、大白菜，为十字花科芸薹属植物，在我国广泛栽培，具有“百菜之王”之称。软腐病一直是制约大白菜高产优质栽培和大面积发展的关键因素之一，在全国各地都普遍发生，且危害期很长。它在田间、贮运期以至市场上都能引起白菜腐烂而造成十分严重的损失，产量损失可达30％-50％，储藏损失可达20％左右。软腐病的病原菌属于欧文氏菌属(Erwinia)，分为3个群，即火疫病菌群(amylorora)、草生欧文氏菌群(herhiacala)和胡萝卜软腐欧文氏菌群(carotovora)。其中胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜致病亚种(Erwiniacarotovorasubsp.Carotovora)是导致白菜软腐病发生的主要致病菌。软腐病病菌在土壤中或在带病残体上越冬，经雨水、灌溉水或者昆虫传播，引起白菜软腐病大面积发生。长期以来，白菜软腐病以化学防治为主，并结合选育抗病品种、优化栽培管理等技术措施。化学防治以大量使用农用链霉素、氯溴异氰尿酸、叶枯唑、森铜悬浮剂等药物为主。大量使用化学农药对人类健康、食品安全和环境保护存在巨大的潜在威胁，已经引起社会的日益关注。发展生物防治技术，减量使用化学农药，是农业发展的必然趋势。生物防治是利用有益生物或其代谢产物来防治病虫害的方法。其特点是不污染环境、对人和其他生物安全、节约能源、保持生态平衡等特点，是发展绿色食品、保护人身健康的重要手段。目前，蜡状芽孢杆菌、哈茨木霉、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、淡紫灰链孢、灰色链霉菌等有益微生物已用于白菜软腐病的生物防治，但由于防治效果有限，未能在农业生产中大面积推广。针对上述现状，本专利技术提供一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌，用于白菜软腐病的生物防治，特别是用于盐碱地栽培的白菜软腐病的生物防治。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株分离自盐碱地白菜根际土壤的太平洋芽孢杆菌(Bacilluspacificus)YJJK-16及其活菌制剂与应用。太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌株耐盐碱能力强，能在盐碱土壤中存活、定植，且对胡萝卜软腐欧文氏菌引起的白菜软腐病具有较高的防效。一株分离自盐碱地白菜根际土壤的太平洋芽孢杆菌(Bacilluspacificus)YJJK-16，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCCNo.18300；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年7月26日。所述太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌株的菌落及菌体特征：在LB培养基上37℃培养2天，菌落呈乳白色，直径1.5-2.5mm，半透明、隆起状，表面光滑湿润，边缘规则，质地较均匀；菌体杆状，有芽孢。其菌落形态和菌体形态分别如图1-2所示。所述太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌株的生理生化特征：革兰氏染色试验阳性、接触酶试验阳性、淀粉水解试验阳性、运动性试验阳性、硝酸盐还原试验阳性、明胶液化试验阳性、D-葡萄糖产酸试验阳性、厌氧生长试验阴性、乙酰甲基甲醇试验阴性、生长温度范围28-40℃、10％氯化钠中生长。所述太平洋芽孢杆菌YJJK-16菌株活菌制剂的制备方法，其特征是，太平洋芽孢杆菌(Bacilluspacificus)YJJK-16经扩大培养(采用LB培养基)后，接种于发酵培养基，35-37℃培养24-28h，得到发酵液，然后加入没食子酸丙酯(PG)0.01-0.02％(w/w)、生化黄腐酸粉5-7％(w/w)和卡松0.01-0.02％(w/w)，搅拌均匀，得到活菌制剂。所述发酵培养基的配方为：豆粕粉15-20g、玉米粉20-25g、酵母浸粉1g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.0g、硫酸锰0.2g、复合酶制剂0.1g、水1000mL，初始pH7.5。所述复合酶制剂的组成为(质量比)：碱性蛋白酶60％、纤维素酶40％。太平洋芽孢杆菌YJJK-16活菌制剂的使用方法：太平洋芽孢杆菌YJJK-16活菌制剂加水稀释200～300倍，移苗时蘸根或浇水时随水冲施。本专利技术的有益效果：本专利技术太平洋芽孢杆菌YJJK-16分离自盐碱地土壤，耐盐碱能力较强，在盐碱土壤中定植率高，且对白菜软腐病病原菌具有较强的抑制作用，可用于生产生物肥料，特别是盐碱地专用微生物肥料，用于白菜软腐病的生物防治，可减少病害发生，提高白菜产量和质量。本专利技术的发酵培养基中添加复合酶制剂，灭菌时在升温过程中对豆粕与玉米粉等原料进行水解，可缩短延迟期，提高原料利用率，提高发酵液中的活菌浓度。发酵液中加入抗氧化剂没食子酸丙酯与对活菌具有保护作用的生化黄腐酸粉，可以减少菌剂在存放过程中的活菌损失，提高产品的生物稳定性。附图说明图1为本专利技术太平洋芽孢杆菌YJJK-16的菌落形态；图2为本专利技术太平洋芽孢杆菌YJJK-16的菌体形态。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1：太平洋芽孢杆菌YJJK-16的筛选(1)耐盐碱菌株的筛选太平洋芽孢杆菌YJJK-16分离自白菜根际土壤。土壤取样于山东省东营市，为盐碱土壤。具体分离方法为：称取10g土样，放入预灭菌的装有90mL去离子水和10-20粒玻璃珠的250mL锥形瓶中，180r/min震荡20min。采用梯度稀释法，将土壤溶液稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。吸取0.1mL不同稀释度的土壤溶液，放入高盐碱选择性培养基平板中，涂布均匀，然后于37℃培养24-48h。根据菌落及菌体形态的差异，将不同菌株分别转接至保藏培养基试管斜面上，37℃培养1-2d，长满菌苔后，置于4℃冰箱中保存备用。共筛选出耐盐碱菌株82株。所述高盐碱选择培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母膏5g、复合无机盐(NaCl∶KCl∶MgCl2＝10∶1∶1)30g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH9.0，121℃灭菌20min。所述保藏培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH7.0，121℃灭菌20min。(2)抑菌圈法筛选白菜软腐病致病菌的拮抗菌株将200mLLB培养基融化，待冷却到45℃左右时，加入5mL(105cfu/mL)的白菜软腐病致病菌——胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜致病亚种(Erwiniacarotovorasubsp.Carotovora)的菌悬液，摇匀，倒入培养皿中。在其上点接步骤(1)筛选到的耐盐碱菌株，每皿接四种不同菌株，于37℃恒温培养48h后，观察各种菌株的生长情况，筛选菌落大、抑菌圈与菌落直径比值大的菌株。共筛选出具有较强抑菌活性的菌株3株。综合考虑所筛3株耐盐碱拮抗菌株的生长速度和对白菜软腐病病原菌的拮抗能力，选取一株作为生产菌株，编号为YJJK-16。实施例2：太平洋芽孢杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌(Bacillus pacificus)YJJK-16，该菌株的保藏编号为CGMCC No.18300。/n

【技术特征摘要】
1.一株耐盐碱太平洋芽孢杆菌(Bacilluspacificus)YJJK-16，该菌株的保藏编号为CGMCCNo.18300。


2.权利要求1所述的耐盐碱太平洋芽孢杆菌YJJK-16在防治欧文氏菌引起的白菜软腐病方面的应用。


3.一种以权利要求1所述的耐盐碱太平洋芽孢杆菌YJJK-16为主要有效成分的活菌制剂。


4.权利要求3所述的活菌制剂的生产方法，其特征是，将权利要求1所述的太平洋芽孢杆菌YJJK-16经扩大培养后，接种于发酵培养基，35-37℃培养24-28h，得到发酵液，然后进一步制备活菌制剂；
所述发酵培养基为：豆粕粉15-20g、玉米粉20-25g、酵母浸粉1g、磷酸二氢钾1.0g、硫...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙中涛，辛寒晓，刘丽英，赵升远，孙国科，杨越超，史庆华，候汉学，寇娟妮，刘珂欣，
申请(专利权)人：山东佐田氏生物科技有限公司，德州佐田康瑞生物科技有限公司，山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37