一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域。具体而言，本发明专利技术提供一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其ELISA试剂盒，尤其涉及密码子优化的一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G‑SA，包括链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白。本发明专利技术提供的ELISA试剂盒的特异性、敏感性和稳定性较好，具有良好的应用前景。

A bifunctional protein with IgG binding activity and biotin binding activity and its ELISA Kit

【技术实现步骤摘要】
一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其ELISA试剂盒
本专利技术涉及免疫检测领域，特别涉及一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA及其ELISA试剂盒。
技术介绍
目前，感染人类的吸虫有三种：即分布于亚洲的日本血吸虫，非洲中部及拉丁美洲的曼式血吸虫和非洲北部的埃及血吸虫，在中国仅日本血吸虫流行，分布于我国长江流域及南方12省，市，自治区，多为我国很重要的农业生产基地，日本血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病，对人民的健康及国家发展危害严重。血吸虫病诊断技术主要包括病原学诊断和免疫学诊断两种，病原学诊断技术以粪便等样本中检查虫卵或孵化毛蚴为手段，但该法检出率较低，对轻度感染或早期感染的检测漏检率极高，不利于疾病的早期诊断。免疫学诊断技术检测主要包括抗原和血清抗体，相比病原学诊断技术具有简便，高效，依从性高等优势，日益受到重视并在业界研发下发展迅速。链球菌蛋白G是一种能够和多种哺乳动物的IgG以及人血清白蛋白(HSA)相结合的蛋白质，SPG同IgG的亲和力强，结合谱广。研究表明，SPG的三个同源的氨基酸序列C1、C2和C3区域与抗体IgGFc端的结合相关，并且C3区与抗体IgG的结合能力相当于C1区的7倍（Kobatake，1990）。而SPG的A、B区则具有与抗体Fab段结合以及与血清白蛋白结合的活性，被认为会起到干扰抗体与抗原的作用以及带来非特异性反应的问题。链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌Streptomycesavidinii分泌的一种四聚体蛋白，与亲和素(avidin，AV)有相似生物学特性。SA可高度特异性地与生物素结合，一分子链霉亲和素可以与四分子生物素结合，形成生物素-链霉亲和素系统。该系统被认为是最稳定的非共价相互作用之一，并在生物
具有广泛的应用，如分子标记、分子定位和靶向药物递送。酶联免疫吸附试验是免疫学诊断技术的一种，该方法具有高度特异性，敏感性，检测结果与粪检阳性符合率达95%-99%。ELISA技术飞速发展，出现了诸多衍生试验，如快速ELISA，微波ELISA，Dot-ELISA等均具有良好的特异性和敏感性。BSA系统作为ELISA法的一种，可显著提高标记免疫检测的灵敏度，在免疫学领域应用广泛。但是常规的BSA法同样不可避免的用到酶标的二抗，根据不同物种来源的一抗，二抗也需要做相应的调整，增加了实验成本也给实验结果准确性带来影响。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种快速、高灵敏的免疫检测产品及方法，实现高效、高密度的免疫检测。为了实现上述技术方案，本专利技术提供一种融合蛋白，基于SPGC3区和SA的特点，将这两段基因连接起来，重构一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA，包括链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白，所述链球菌蛋白G（SPG）片段为含有SPG的C3区段的序列；其中，链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白之间的连接序列为如SEQIDNO.8所示所述链球菌蛋白G（SPG）片段的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；SA蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；所述双功能蛋白G-SA的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；本专利技术同时提供一种密码子优化的序列，对SPG和SA序列进行密码子优化，拼接后蛋白表达量提高，可溶性增加。本专利技术同时提供一种双功能蛋白G-SA的构建方法，所述方法为：根据G蛋白的C3片段的基因序列，从含有C3片段的菌液中PCR扩增出C3序列；（1）通过PCR从含有SA序列的菌液中扩增出SA序列；（2）先将扩增出的SA序列双酶切后，连接到表达载体上，经鉴定后再将C3片段双酶切后连接上去，构建重组蛋白的原核表达质粒；（3）将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白；（4）经破碎、纯化后制得融合蛋白G-SA其中，步骤（1）中使用的引物对如SEQIDNO.1、2所示；步骤（2）中使用的引物对如SEQIDNO.3、4所示；上述方法中，融合蛋白基因的表达、纯化可采用本领域常规用于蛋白表达纯化的方法，例如将融合蛋白基因克隆入表达载体，将表达载体和/或共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白，经破碎、纯化后得到融合蛋白。其中，本专利技术对表达载体、表达宿主的种类和类别不作限定，可选用本领域常规用于遗传修饰的载体和宿主，具体的，表达载体可为pET-28、pET-32、pET-15或pET-11的等，；表达宿主可选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞。本专利技术中，克隆可通过例如链式酶聚合反应(PCR)完成。进一步的，本专利技术提供一种ELISA试剂盒，其中所述ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒中包括：双功能蛋白G-SA、封闭液（5%脱脂奶粉），酶标二抗（HRP标记的生物素和亲和素），PBST，显色液（TMB底物液）、终止液（2mol/L硫酸）。同时，本专利技术提供一种ELISA试剂盒的非诊断目的的应用，所述应用为抗体检测、抗体筛选、抗原检测、病原检测、蛋白检测、蛋白相互作用筛查、高通量靶标蛋白检测、蛋白-核酸相互作用分析、药物筛选等。附图说明图1SPG的结构示意图。图2对重组蛋白的原核表达质粒，进行PCR鉴定，其中，M：核酸标志物；1：G-SA序列；2：C3序列；3.SA序列。图3重组质粒的双酶切鉴定，其中，M：核酸标志物1：PET-28a空载体；2：G-SA基因。图4SDS-PAGE分析pET-28a（+）-C3-SA表达情况，其中，M：蛋白标志物；0：无IPTG诱导；1、2、4、6、8：IPTG诱导1h，2h，4h，6h，8h。图5SDS-PAGE分析pET-28a（+）-C3-SA上清蛋白纯化情况M：蛋白标志物；1：超声破碎上清液；2：上样后；3：超声破碎沉淀；4：BindingBuffer纯化后；5：WashingBuffer纯化后；6：StripBuffer纯化后。图6Westernblotting检测G-SA蛋白与不同物种IgG、生物素以及His抗体的结合活性图A：1：蛋白maker；2：鼠抗兔；图B：1：蛋白maker；2：驴抗羊；图C：1：蛋白maker；2：羊抗鼠；图D：1：蛋白maker；2：兔抗山羊；图E：1：蛋白maker；2：HRP-bio；图F：1：蛋白maker；2：His抗体。图7G-SA与不同物种抗体、生物素的亲和常数曲线图8新型ELISA系统模式图图9重组蛋白最适孵育浓度摸索图10新型ELISA检测法的多物种检测，灵敏度检测图11新型ELISA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种兼有IgG 结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA，其特征在于所述双功能蛋白G-SA包括链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白，所述链球菌蛋白G（SPG）片段为含有SPG的C3区段的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA，其特征在于所述双功能蛋白G-SA包括链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白，所述链球菌蛋白G（SPG）片段为含有SPG的C3区段的序列。


2.如权利要求1所述的兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA
其中，链球菌蛋白G（SPG）片段和SA蛋白之间的连接序列为如SEQIDNO.8所示
所述链球菌蛋白G（SPG）片段的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
SA蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。


3.如权利要求1所述的兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA，所述双功能蛋白G-SA的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。


4.一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA的表达方法，所述方法为：根据G蛋白的C3片段的基因序列，从含有C3片段的菌液中PCR扩增出C3序列；
通过PCR从含有SA序列的菌液中扩增出SA序列；
先将扩增出的SA序列双酶切后，连接到表达载体上，经鉴定后再将C3片段双酶切后连接上去，构建重组蛋白的原核表达质粒；
将所述表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导剂表白蛋白；
经破碎、纯化后制得融合蛋白G-S。


5.如权利要求4所述的表达方法，其中，步骤（1）中使用的引物对如SEQIDNO.1、2所示；
步骤（2）中使用的引物对如SEQIDNO.3、4所示。


6.一种用于免疫分析的产品，所述产品包括权利要求1所述的一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白G-SA。


7.如权利要求6所述的产品，产品的形式可为探针(传感器)、试纸条、芯片、试剂盒等，在使用时，将本发明所述的融合蛋白与其它现有的商业试剂(如...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱传刚，纪荣毅，袁娜娜，张霁月，沈元曦，林矫矫，洪炀，马以桐，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：上海;31