【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单倍体机能不全的基因疗法相关申请的交叉引用本申请要求于2017年2月7日提交的美国临时申请62/455,988号的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。联邦资助的研究与开发下作出专利技术的权利声明本专利技术是在政府支持下由国家卫生研究院授予的基金号R01DK090382资助完成。政府对本专利技术拥有一定的权利。提交序列表的引用本申请包括2018年2月6日生成的名为“081906-224410PC-1072775_SequenceListing.txt”的文本文件的序列表并且含有107kb。该文本文件中包含的材料通过引用全文纳入用于所有目的。专利
本公开一般涉及用于激活哺乳动物细胞中的转录的方法和组合物。
技术介绍
导致一种或多种基因或基因产物的转录或活性降低的基因组改变是无数哺乳动物疾病的致病因素。一种这样的基因组改变是单倍体机能不全(haploinsufficiency)，其中只有一个基因的功能性拷贝，并且单个拷贝不产生足够的基因产物以产生野生型表型。其他疾病是由改变基因产物的基因的一个或两个拷贝中的基因组改变引起的，因此它表现出活性的降低但不消除。在其他疾病中，基因组改变降低基因的一个或两个拷贝的转录或降低转录物稳定性，使得基因产物不足以产生野生型表型。已经尝试了许多方法通过增加转录或活性降低的一种或多种基因的量或活性来治疗这些疾病。这些方法包括将一种或多种基因的野生型拷贝递送到基因组中。最近，已经使用基于聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)，锌指核酸酶(...
【技术保护点】
1.一种治疗哺乳动物对象中单倍体机能不全疾病的方法，所述方法包括使所述对象的细胞与组合物接触，所述组合物包含：/ni)向导RNA，其中所述向导RNA包含：/na)靶向区域，其在所述细胞的核中存在的条件下，与和单倍体机能不全的基因的野生型拷贝操作性地连接的启动子区域或增强子区域特异性杂交；和/nb)CRISPR核酸酶结合区域，其在所述细胞的核中存在的条件下特异性结合CRISPR核酸酶，或特异性结合CRISPR核酸酶结合区域的区域；和/nii)CRISPR核酸酶，/n-其中所述接触形成包含与向导RNA结合的CRISPR核酸酶的复合物，其中所述复合物中向导RNA的靶向区域与所述启动子或增强子杂交；/n-其中所述复合物包含催化失活的CRISPR核酸酶和转录激活结构域，并且/n-其中所述复合物以足以治疗所述对象中的单倍体机能不全疾病的量和持续时间激活单倍体机能不全的基因的野生型拷贝的转录。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170207 US 62/455,9881.一种治疗哺乳动物对象中单倍体机能不全疾病的方法，所述方法包括使所述对象的细胞与组合物接触，所述组合物包含：
i)向导RNA，其中所述向导RNA包含：
a)靶向区域，其在所述细胞的核中存在的条件下，与和单倍体机能不全的基因的野生型拷贝操作性地连接的启动子区域或增强子区域特异性杂交；和
b)CRISPR核酸酶结合区域，其在所述细胞的核中存在的条件下特异性结合CRISPR核酸酶，或特异性结合CRISPR核酸酶结合区域的区域；和
ii)CRISPR核酸酶，
-其中所述接触形成包含与向导RNA结合的CRISPR核酸酶的复合物，其中所述复合物中向导RNA的靶向区域与所述启动子或增强子杂交；
-其中所述复合物包含催化失活的CRISPR核酸酶和转录激活结构域，并且
-其中所述复合物以足以治疗所述对象中的单倍体机能不全疾病的量和持续时间激活单倍体机能不全的基因的野生型拷贝的转录。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述接触包括使细胞与编码向导RNA或CRISPR核酸酶的附加型载体接触。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述接触包括使细胞与编码向导RNA和CRISPR核酸酶的附加型载体接触。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述接触包括使细胞与编码向导RNA的附加型载体和编码CRISPR核酸酶的第二附加型载体接触。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述附加型载体是非整合的。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述附加型载体是非复制性的。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述附加型载体是腺相关病毒(AAV)载体。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述附加型载体独立地包含第一末端和第二末端，其中第一末端和第二末端各自独立地包含AAV反向末端重复序列。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CRISPR核酸酶包含(i)经修饰以消除核酸酶和切口活性的核酸酶结构域和(ii)转录激活结构域。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述修饰包括在对应于化脓性链球菌Cas9的D10和H840的位置处的突变。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CRISPR核酸酶包含D10A，H840A化脓性链球菌dCas9。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包含死亡指导序列。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包含转录激活结合结构域，其中所述转录激活结合结构域特异性结合包含一种或多种转录激活结构域的组合物。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含与向导RNA结合的CRISPR核酸酶的所述复合物还包含选自下组的转录激活结构域：HSF1，VP16，VP64，p65，MyoD1，RTA，SET7/9，VPR，组蛋白乙酰转移酶p300，TET家族蛋白的羟化酶催化结构域(例如，TET1羟化酶催化结构域)，LSD1，CIB1，AD2，CR3，EKLF1，GATA4，PRVIE，p53，SP1，MEF2C，TAX和PPARγ。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CRISPR核酸酶是CRISPR核酸酶-VP64融合多肽。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包含支架区域。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述支架区域包含ms2，f6，PP7，com或L7a配体序列。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述复合物中向导RNA的支架区域与融合至MCP多肽，COM多肽，PCP多肽或L7a多肽的转录激活结构域结合。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单倍体机能不全的基因是SIM1，瘦蛋白，瘦蛋白受体，MC4R，SCN2A，SETD5，PAX6，PKD1，MC3R，POMC，STAT3，STAT5，SOCS3，GHR，NPY，NPY1R，NPY2R，NPY5R，PYY，AMPK(PRKAA1，PRKAA2，PRKAB1，PRKAB2，PRKAG1，PRKAG2，PRKAG3)，OXT，JAK2，SHP2，NOS3，NROB2，BRS3，CARTPT，FABP4，HTR2C，IL6，NHLH2，NMU，NPB，NPBWRI，PNPLA2，UCP3，ADIPOQ，APOA5，ARNT2，ASIP，C1QTNF2，C3AR1，CCK，CPT1B，CSF2，DGAT1，DGAT2，GHRL，GHSR，HSD11B1，HTR7，INSIG1，INSIG2，LIPC，NMURI，NMUR2，NPBWR2，NTS，PPARGC1A，PPY，RETN，SIRT1，TGFBR2，WDTC1，或FOXO1。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述向导RNA的靶向区域由以下编码或与以下特异性杂交：
SEQIDNO：1(GACACGGAATTCATTGCCAG)，
SEQIDNO：2(CTGCGGGTTAGGTCTACCGG)，
SEQIDNO：3(GTTGAGCGCTCAGTCCAGCG)，
SEQIDNO：4(TCCCGACGTCGTGCGCGACC)，或
SEQIDNO：5(GCTCTGAATCTTACTACCCG)。
21.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述向导RNA的靶向区域由以下编码或与以下特异性杂交：
SEQIDNO：6(GCTGTTAACTAAAGACAGGG)，
SEQIDNO：7(GTGGTCTGGGTGATCTCATG)，
SEQIDNO：8(GACAAAGGAACATCTGAGAGG)，
SEQIDNO：9(GTGATCTCATGGGGAAGAGG)，或
SEQIDNO：10(GGCTTTGATCGTGGTCTGGG)。
22.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述向导RNA的靶向区域由以下编码或与以下特异性杂交：
SEQIDNO：11(GCGAGCCCAGTCGCGTGGGG)，
SEQIDNO：12(GCCAAGAATTGGCCAAAGGG)，
SEQIDNO：34(GTCAAAGGGGCATATGGAAGG)，
SEQIDNO：35(GGGAAGAAAGCCCCACTTGG)，
SEQIDNO：36(GCCCAGTCGCGTGGGGGGGG)，或
SEQIDNO：37(GGAGCGCGAGTGTCACTCGG)。
23.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述向导RNA的靶向区域由以下编码或与以下特异性杂交：
SEQIDNO：38(GCTCACTGTAGGACCCGAGCC)，
SEQIDNO：39(GACGCGGCGCTCATTGGCCAA)，
SEQIDNO：40(CGAGCCGCGAGCCCAGTCGCG)，
SEQIDNO：41(TCCCCCCCCCCCCCCACGCGA)，
SEQIDNO：42(GTCACTCACCCCGATTGGCCA)，或
SEQIDNO：43(CGCGAGCCCAGTCGCGTGGGG)。
24.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述向导RNA的靶向区域由以下编码或与以下特异性杂交：
SEQIDNO：44(GTTGGCTTATCCAAACATCTC)，
SEQIDNO：45(ATGTTAAGCAAGGGTAATAGA)，
SEQIDNO：46(CTGTGAAAGGAATACAATTCA)，
SEQIDNO：47(GCCAATTCTTGGCAACCGAGC)，
SEQIDNO：48(GAATTGGCCAAAGGGAGGGGT)，或
SEQIDNO：49(AATTAGCAGACAGCTTGGTAC)。
25.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述向导RNA的靶向区域由以下编码或与以下特异性杂交：
SEQIDNO：50(CTGGCTGATTCCCGAGGATTT)，
SEQIDNO：51(CACTGAATACGGATTGGTCAG)，
SEQIDNO：52(GATGTCTCAGAACCACT...
【专利技术属性】
技术研发人员：N·阿黑度威，N·玛莎鲁，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。