主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法技术

本发明专利技术涉及一种主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法，本发明专利技术首先提供了一种用于检测酶活性浓度的分子组合，包括DNA‑肽分子和葫芦脲，所述DNA‑肽分子由双链DNA分子和肽分子组成，肽分子的羧基端共价连接于双链DNA分子的5’端或3’端；所述DNA‑肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态。当待测酶通过酶促反应将部分肽链切除后，暴露出(或丢失掉)的芳香族氨基酸能够(不能)与葫芦脲发生主客体作用而形成(无法形成)DNA主客体探针。这种DNA主客体探针穿越纳米孔时将产生特征电流信号，通过检测电流信号即可实现对酶活性浓度的高灵敏度、特异性检测。

【技术实现步骤摘要】
主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法
本专利技术涉及超分子化学
，具体涉及一种主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法。
技术介绍
蛋白酶作为一类重要的生物标志物，对其活性的快速灵敏检测不仅对于肿瘤早期诊断意义重大，同时也是疗效观察、肿瘤分期判断及预后的重要手段。荧光光谱法是目前最为普遍的酶活性浓度检测技术。尽管荧光法具有很高的灵敏度与较好的空间分辨率，但荧光探针通常需要复杂的设计并且自体荧光现象所产生的背景干扰将导致信噪比下降进而影响方法的灵敏度及成像质量。近些年随着纳米技术的飞速发展，相继开发出各种基于纳米材料以实现高灵敏度、高选择性检测酶活性浓度的方法。但仍需要借助大型仪器且过程繁琐。因此发展简单、高效的酶活性浓度检测方法变得愈发迫切。由于DNA具有丰富多样的“工具箱”性质，并且碱基上或链末端上可进行多种修饰等优势而可以被设计成各种功能不同的纳米机器。2019年，Ricci等人利用修饰了花菁染料的DNA纳米机器实现了对脲酶的高灵敏度快速检测。但由于该方法依赖于光学信号，因此存在着光漂白、荧光寿命短、背景干扰高等问题，尤其是背景干扰极易得出假阳性结论。因此研究开发出基于DNA分子探针的高灵敏度、高选择性、低背景干扰的酶活性浓度检测方法对于肿瘤的早期诊断及治疗、预后有着重要意义。纳米孔单通道技术是自二十世纪九十年代中期起在电生理学研究的基础上发展起来的新兴检测手段。所谓纳米孔就是孔径尺寸在纳米尺度的孔道，通常为1-100纳米。当两个充满电解液的相互绝缘的隔室通过纳米级孔道连通，在外加电场作用下，溶液中的电解质离子定向迁移并穿过纳米孔从而产生电流，经膜片钳系统测量、放大和转换后被记录。当溶液中存在待检测物质时，该物质在扩散作用或电压驱动下穿越纳米孔，此时孔道内通过的离子数目由于待测物的占据而产生变化，从而导致记录到的电流发生改变，电流信号包含两个特征量：电流阻滞振幅(amplitude)和电流阻滞时间(dwelltime)，从中可以分析得出丰富的物性信息：物质的种类、结构、构象变化和分子组成等。通常情况下，生物型纳米孔的灵敏度和信噪比要比人造材料纳米孔好得多，因此生物纳米孔更有利于实现高灵敏度检测。但是生物纳米孔是通过质粒表达得来的，其几何尺寸已经固定，因此只有大小与其匹配的分子才可以穿越。而蛋白酶的尺度通常在十纳米左右，因此无法穿越αHL纳米孔。2011年JACS发表了基于核酸适体结合αHL纳米孔检测可卡因的工作。当核酸适体结合可卡因后会形成Y型复合结构。该结构无法穿越纳米孔而发生长时间电流堵塞，也正是利用了这种堵塞电流信号实现了可卡因快速检测。但是堵塞信号非常不利于高灵敏度检测，因为其信号特征性低，背景干扰较强。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法。为此，本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测酶活性浓度的分子组合，所述分子组合包括DNA-肽分子和葫芦脲；所述DNA-肽分子由双链DNA分子和肽分子组成，所述肽分子的羧基端共价连接于所述双链DNA分子的5’端或3’端；所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态；所述改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为：(i)所述DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸；或，(ii)所述DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸；所述DNA-肽分子和葫芦脲的摩尔比为1:10-250，优选为1:10-150。进一步，所述双链DNA分子的长度为20-60bp。进一步，所述芳香族氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；优选为苯丙氨酸。进一步，所述经待测酶作用后的DNA-肽分子中的氨基酸数目小于等于20，优选为小于等于15。进一步，所述葫芦脲选自下组：葫芦[6]脲(CB[6])，葫芦[7]脲(CB[7])，葫芦[8]脲(CB[8])；优选为葫芦[7]脲。本专利技术的第二方面，提供了一种用于检测酶活性浓度的主客体探针，由DNA-肽分子和葫芦脲共孵育形成；所述DNA-肽分子由双链DNA分子和肽分子组成，所述肽分子的羧基端共价连接于所述双链DNA分子的5’端或3’端；所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态；所述改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为：(i)所述DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸；或，(ii)所述DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸；当所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为(i)时，所述主客体探针由经待测酶作用后的DNA-肽分子与所述葫芦脲共孵育形成，所述葫芦脲与经待测酶作用后的DNA-肽分子中的氨基端芳香族氨基酸通过主客体超分子作用连接；当所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为(ii)时，所述主客体探针由未经待测酶作用的DNA-肽分子与所述葫芦脲共孵育形成，所述葫芦脲与DNA-肽分子中的氨基端芳香族氨基酸通过主客体超分子作用连接；所述DNA-肽分子和葫芦脲的摩尔比为1:10-250，优选为1:10-150。进一步，所述双链DNA分子的长度为20-60bp。进一步，所述芳香族氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；优选为苯丙氨酸。进一步，所述经待测酶作用后的DNA-肽分子中的氨基酸数目小于等于20，优选为小于等于15。进一步，所述葫芦脲选自下组：葫芦[6]脲(CB[6])，葫芦[7]脲(CB[7])，葫芦[8]脲(CB[8])；优选为葫芦[7]脲。进一步，所述DNA-肽分子和所述葫芦脲共孵育的反应条件为4℃，反应时间为1-3h，优选为2h。本专利技术的第三方面，提供了所述主客体探针的制备方法，包括，当所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为(i)时，所述主客体探针的制备方法为：将所述DNA-肽分子与待测酶混合，使待测酶对所述DNA-肽分子发生酶促反应，随后加入所述葫芦脲进行共孵育，得到所述主客体探针；当所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为(ii)时，所述主客体探针的制备方法为：将所述DNA-肽分子与所述葫芦脲进行共孵育，得到所述主客体探针。进一步，所述共孵育的反应条件为4℃，反应时间为1-3h，优选为2h。本专利技术的第四方面，提供了一种系统，包括本专利技术所述的分子组合和样品池，或本专利技术所述的主客体探针和样品池；所述样品池包括两个隔室，两个隔室被绝缘膜分隔；所述绝缘膜上具有一个直径为100-150μm的通孔，所述通孔被磷脂双分子层充满，在所述磷脂双分子层中存在一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测酶活性浓度的分子组合，其特征在于，所述分子组合包括DNA-肽分子和葫芦脲；/n所述DNA-肽分子由双链DNA分子和肽分子组成，所述肽分子的羧基端共价连接于所述双链DNA分子的5’端或3’端；/n所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态；/n所述改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为：(i)所述DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸；或，(ii)所述DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸；/n所述DNA-肽分子和葫芦脲的摩尔比为1:10-250。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测酶活性浓度的分子组合，其特征在于，所述分子组合包括DNA-肽分子和葫芦脲；
所述DNA-肽分子由双链DNA分子和肽分子组成，所述肽分子的羧基端共价连接于所述双链DNA分子的5’端或3’端；
所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态；
所述改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为：(i)所述DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸；或，(ii)所述DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸；
所述DNA-肽分子和葫芦脲的摩尔比为1:10-250。


2.如权利要求1所述的分子组合，其特征在于，所述双链DNA分子的长度为20-60bp。


3.如权利要求1所述的分子组合，其特征在于，所述芳香族氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸。


4.如权利要求1所述的分子组合，其特征在于，所述经待测酶作用后的DNA-肽分子中的氨基酸数目小于等于20。


5.如权利要求1所述的分子组合，其特征在于，所述葫芦脲选自下组：葫芦[6]脲，葫芦[7]脲，葫芦[8]脲。


6.一种用于检测酶活性浓度的主客体探针，其特征在于，由DNA-肽分子和葫芦脲共孵育形成；
所述DNA-肽分子由双链DNA分子和肽分子组成，所述肽分子的羧基端共价连接于所述双链DNA分子的5’端或3’端；
所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态；
所述改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为：(i)所述DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸；或，(ii)所述DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸，经待测酶作用后的DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸；
当所述DNA-肽分子经待测酶作用后，改变氨基端芳香族氨基酸的暴露状态为...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴海臣，郭秉元，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11