一种基于差分离子迁移谱-质谱联用的差向异构体的分离方法技术

本公开建立了一种基于差分离子迁移‑质谱联用的O‑糖基化肽段差向异构体的分离和鉴定方法，属于生物医药和食品/保健品的检测和分析领域。本公开的方法能够检测O‑乙酰氨基葡萄糖化的差向异构体蛋白质或多肽，这为研发治疗神经性系统疾病等的新药奠定了良好的基础，同样的，在生物医药和食品/保健品分析领域中具有十分重要的意义。而且本公开首次使用差分离子迁移谱‑质谱联用的技术实现了生物体中十分重要的物质‑O‑糖基化蛋白质或肽段的分离和识别，推动了生物大分子O‑糖基化蛋白质或肽段的鉴定技术的发展。

A method for the separation of epimer based on differential ion mobility spectroscopy mass spectrometry

【技术实现步骤摘要】
一种基于差分离子迁移谱-质谱联用的差向异构体的分离方法
本公开涉及一种基于差分离子迁移谱-质谱联用的差向异构体的分离方法，属于生物医药和食品/保健品的检测分析领域。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。在生物体中，蛋白质糖基化是一种细胞中广泛存在、复杂的蛋白质翻译后修饰，大约有50％的人类蛋白质分子是糖基化的。糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响，比如，免疫系统中几乎所有的关键分子都是糖蛋白，免疫球蛋白糖链异常是自身免疫疾病的元凶；透明带糖蛋白ZP3决定了卵子与精子的结合，其糖链是精-卵结合的牵线人；等等。糖基化类型主要可分为两种：N-糖基化和O-糖基化，而其中，O-糖基化包含有一个单糖单元在细胞功能和失调方面具有重要的作用，比如，蛋白质的O-乙酰氨基葡萄糖化被发现参与多个信号网络，与神经性系统疾病(比如阿兹海默氏症等)、自身免疫性疾病等疾病密切相关。可见，对于糖蛋白的研究具有十分重要的生物学意义和临床应用价值，尤其是研究作为生物医药等的复合糖蛋白/肽。目前，复合糖立体化学的鉴定归属基于所有去糖基化酶和具有严格的底物特异性。但是最新的研究表明，pp-α-GanT2肽能够介导生物合成含有乙酰基葡糖胺和乙酰基半乳糖胺残基的差向异构糖肽。在药物和食品/保健品领域，这种差向异构糖肽往往只有一种形式是具有活性的，或者是不同差向异构糖肽具有不同的功能活性的，或者是只有一种形式能表征药物疗效的，所以在实际中，需要准确分离、识别非目的差向异构糖肽是否存在以及测定其含量等。所以为了避免对于糖肽结构的错判等问题，需要开发快速和/或高灵敏度的复合糖差向异构体的区分方法。目前，基于质谱的糖肽和糖蛋白中糖基团的归属和定位作为主要的手段，仍然存在技术挑战。多种串联质谱技术，包括碰撞裂解，电子捕获裂解和电子诱导裂解，电子转运裂解，以及复合裂解技术，被用来进行糖基化修饰位点的定位。但是，包含单个差向异构单糖的非对映复合糖异构体仍然不能通过质谱进行区分。
技术实现思路
针对以上
技术介绍
，本公开建立了一种基于差分离子迁移-质谱联用的O-糖基化肽段差向异构体的分离和鉴定方法。通过在差分离子迁移谱注入微量的挥发性有机调节剂，实现了糖肽差向异构体的基线分离，为实现糖肽差向异构体的完全分离奠定基础，在生物医药和食品/保健品分析领域中具有十分重要的意义。具体的，本公开采用以下技术方案：在本公开的第一个方面，提供一种O-糖基化肽段差向异构体的分离方法，该方法包括：以含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的混合物为待分析样品，采用差分离子迁移谱技术进行分离；其中，以正丙醇(又称1-丙醇)、正丁醇(又称1-丁醇)、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。在本公开的第二个方面，提供一种O-糖基化肽段差向异构体的检测分析方法，该方法包括：以含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的混合物为待分析样品，采用差分离子迁移谱-质谱联用进行分离；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。在本公开的第三个方面，提供一种判断是否含有O-糖基化肽段差向异构体的方法，该方法包括：以怀疑含有O-糖基化肽段差向异构体的混合物为待分析样品，采用差分离子迁移谱进行测定；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。在本公开的第四个方面，提供一种O-糖基化蛋白质差向异构体的分离或鉴定方法，该方法包括：以含有至少两种互为O-糖基化蛋白质差向异构体的混合物为待分析样品，对待分析样品进行预处理，产生含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的多种肽段混合液；然后采用所述O-糖基化肽段差向异构体的分离或检测分析方法进行操作，即可实现O-糖基化蛋白质差向异构体的分离或鉴定。在本公开的第五个方面，提供一种判断是否含有O-糖基化蛋白质差向异构体的方法，该方法包括：以怀疑含有O-糖基化蛋白质差向异构体的混合物为待分析样品，对待分析样品进行预处理，产生含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的多种肽段混合液；采用差分离子迁移谱进行测定；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。与本专利技术人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：(1)本公开实现了糖肽差向异构体的基线分离，不使用昂贵的分离色谱柱，有机溶剂(即挥发性的有极气体调节剂)的消耗量不超过20微升，绿色环保，分析时间短于超高效液相色谱系统，灵敏度高，最高可达到fM级别，样品之间无需对于系统的延时冲洗，不存在样品间的交叉污染，操作简便。(2)蛋白质的O-乙酰氨基葡萄糖化被发现参与多个信号网络，与神经性系统疾病(比如阿兹海默氏症等)、自身免疫性疾病等疾病密切相关。而本公开的方法能够检测O-乙酰氨基葡萄糖化的差向异构体蛋白质或多肽，这为研发治疗神经性系统疾病等的新药奠定了良好的基础。(3)本公开首次使用差分离子迁移谱-质谱联用的技术实现了生物体中十分重要的物质-O-糖基化蛋白质或肽段的分离和识别，推动了生物大分子O-糖基化蛋白质或肽段的生物检测技术的发展。附图说明构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。图1是本公开三个糖肽的质谱图；图2是本公开补偿电压随1-丙醇浓度的变化趋势；图3是本公开补偿电压与调节剂浓度的变化图，(a)1-丁醇；(b)乙腈；(c)1-丙硫醇；图4是本公开糖肽差向异构体的叠加信号谱图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。术语解释：差向异构体：在立体化学中，含有多个手性中心的立体异构体中，只有一个手性中心的构型不同，其余的构型都相同的非对映体叫差向异构体；比如，与葡萄糖互为差向异构体的有：甘露糖(C2)，阿洛糖(C3)，半乳糖(C4)。O-糖肽键：指单糖的异头碳与羟基氨基酸的羟基O原子共价结合而成的O-糖苷键。异头碳：单糖由直链变成环状结构时，羰基碳原子成为新的手性中心，导致C1差向异构化，产生两个非对映异构体，其中，在环状结构中，半缩醛碳原子称为异头碳原子。基线分离、准基线分离：基线分离一般认为是相邻两个峰的分离度大于1.5，或者相邻两峰的峰谷位于基线上，准基线分离可以理解为具备了两个峰基线基本分离的条件。...

【技术保护点】
1.一种O-糖基化肽段差向异构体的分离方法，其特征是，该方法包括：/n以含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的混合物为待分析样品，采用差分离子迁移谱技术进行分离；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种O-糖基化肽段差向异构体的分离方法，其特征是，该方法包括：
以含有至少两种互为O-糖基化肽段差向异构体的混合物为待分析样品，采用差分离子迁移谱技术进行分离；其中，以正丙醇、正丁醇、乙腈或1-丙硫醇为气体调节剂。


2.如权利要求1所述的方法，其特征是，O-糖基化肽段为一个单糖和一段多肽通过O-糖肽键形成的包含单个差向异构单糖的非对映复合糖异构体。


3.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述单糖为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、乙酰氨基葡萄糖、乙酰氨基甘露糖、乙酰氨基半乳糖或者乙酰氨基阿洛糖；
进一步的，所述多肽的长度为2～100个氨基酸分子；
更进一步的，所述多肽的长度为2～50个氨基酸分子。


4.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述差分离子迁移谱技术中，采用电喷雾离子源、正离子模式；
进一步的，电喷雾电压为3.0～3.5kV。


5.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述差分离子迁移谱技术的参数为：平板型电极，平板间距为1.4mm，长度为80mm，宽度为20mm，补偿电压的扫描范围为-50V～+100V，色散场常数设置为127Td；
进一步的，进样量为20μL；
进一步的，待分析样品的进样速度为0.4～0.6μL/min；
进一步的，气体调节剂的浓度为0.2～0.5％；更进一步选择为0.45％；
进一步的，当待分析样品为包含葡萄糖、半乳糖和/或甘露糖的O-糖基蛋白质或肽段时，气体调节剂选择为正丙醇。


6.一种O-糖基化肽段差向异构体的检测分析方法，其特征是，该方法包括：

【专利技术属性】
技术研发人员：陈相峰，吴日，陈德华，杨敏莉，张峰，
申请(专利权)人：山东省分析测试中心，
类型：发明
国别省市：山东;37