本发明专利技术属于转基因玉米相关成分真伪鉴定方法，具体地说是利用环介导等温扩增(LAMP)技术检测转基因玉米外源抗除草剂bar基因、pat基因的方法。该方法根据转基因玉米外源抗除草剂bar基因、pat基因设计了特异性的LAMP引物，并提供了配套的试剂盒、检测方法和用途。本发明专利技术结合可视化报告方式，以中性红pH指示剂进行比色检测可实现一步可视化的比色检测。本发明专利技术在等温条件下进行，无需精密的变温设备，便捷、准确、分辨率高，检测过程无需开盖操作，适合于现场快速检测。
Detection method and kit of Transgenic Herbicide Resistant foreign gene based on lamp technology
【技术实现步骤摘要】
基于LAMP技术的转基因抗除草剂外源基因的检测方法及试剂盒
本专利技术属于转基因相关成分检测鉴定方法，具体地说是利用LAMP技术分别检测转基因抗除草剂外源bar基因、pat基因的方法。
技术介绍
自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术(geneticallymodifiedorganisms，GMOs)发展十分迅速，并已应用于农业、医药、工业等多个领域。1996年转基因作物开始商业化种植，全球转基因作物的种植面积逐年增加。然而，转基因作物对于人体健康、生态环境等的风险一直存在争议，为了规范管理转基因作物、保障消费者的知情权，世界各国都在努力制定相应的法律和法规,以加强对转基因作物及其产品的管理。因此，亟需建立一套快速、简便、准确的快速检测方法，建立转基因生物安全检测技术体系，以满足相关检验机构的日常现场快速检测的需求。随着分子生物学技术的发展，许多以DNA分子为目标的检测方法已被广泛应用。目前检测转基因作物的方法主要有定性PCR法、实时荧光定量PCR法(RT-PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)等。定性PCR技术操作繁琐，实时荧光定量PCR法检测成本高，且两者都难以实现现场检测。环介导等温扩增技术(LAMP)技术是一种在等温条件下进行的核酸体外扩增技术，在较短的反应时间内表现出较高的灵敏度和扩增效率，目前LAMP方法已经成为最常用的等温扩增手段之一。但目前常用的LAMP反应产物分析手段为实时荧光报告的方式、终点荧光/浊度报告法，需配备专用检测设备，同样难以适用于现场快速筛查。近年来，可视化分析方法在快速现场检测中展现优势。可视化染料比色分析既提高了肉眼的识别率，操作又更为简单，在保证其准确率的情况下，可直接用于快速的现场检测，有报导利用pH指示剂中性红(neutralred,N-red)作为一步可视化的报告方法，可使LAMP技术在现场快速检测领域具有更大的优势。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供基于LAMP技术检测转基因抗除草剂外源bar基因、pat基因的LAMP引物、试剂盒、检测方法和用途。本专利技术转基因抗除草剂外源bar基因检测的特异性LAMP引物是根据转基因抗除草剂外源bar基因DNA序列的保守区域设计的。从GeneBank中查找到转基因抗除草剂外源bar基因设计了LAMP引物。其核苷酸序列如下所示：外引物barB3：AGGTGGACGGCGAGGT外引物barF3：TGCATGCGCACGCTC内引物barBIP：TGGCGGGGGGAGACGTACAGGGTCCCTGGAAGGCA内引物barFIP：TGCTGAAGTCCCTGGAGGCACAGTTGGGCAGCCCGATG环引物barLB：CGGTTGACTCGGCCGTCCAGTCGTAGGCGTTGCG环引物barLF：GGGCTTCAAGAGCGTGGTCGCTGT。本专利技术转基因抗除草剂外源pat基因设计的特异性LAMP引物是根据转基因抗除草剂外源pat基因的序列设计的。从GeneBank中查找到转基因Bt176中外源cry1Ab基因设计了LAMP引物。其核苷酸序列如下所示：外引物patB3：GGTAACTGGCCTAACTGGC外引物patF3：GGCGCAAGGTTTTAAGTCTG内引物patBIP：ATTGCGCGCAGCTGGATACAA-GGAGGAGCTGGCAACTCA内引物patFIP：TACCCCGGGCTGTGTATCCC-ATAGGCCTTCCAAACGATCC环引物patLB：GCATGGTGGATGGCATGATGTTGGTTTTTGGCAAAGGGA环引物patLF：AAGCCTCATGCAACCTAACAGAT。本专利技术基于LAMP技术检测转基因抗除草剂外源bar基因或pat基因的基础检测试剂盒包括上述相应基因的LAMP外引物、内引物、DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、10xLAMP反应缓冲液、去离子水。本专利技术基于LAMP技术检测转基因抗除草剂外源bar基因或pat基因的加速检测试剂盒还包括上述相应基因的LAMP外引物、内引物、环引物、DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、10xLAMP反应缓冲液、去离子水。本专利技术基于LAMP技术检测转基因抗除草剂外源bar基因或pat基因的基础检测试剂盒或加速检测试剂盒还可以包括信号报告分子用于指示检测结果：以荧光信号指示结果时，信号报告分子可以是荧光分子如SYBRGreenI；以肉眼可见的比色信号指示结果时，信号报告分子可以是羟基萘酚蓝或中性红等。优选的，上述10xLAMP反应缓冲液包括200mmol/LTris-HCl(pH8.8)，600mmol/LKCl，80mmol/LMgSO4，100mmol/L(NH4)2SO4，1％TritonX-100。特别的，以中性红为信号报告分子时，优选的上述反应缓冲液包括50mmol/LTris-HCl(pH8.8)，600mmol/LKCl，80mmol/LMgSO4，100mmol/L(NH4)2SO4，1％TritonX-100。本专利技术基于LAMP技术的转基因抗除草剂外源bar基因或pat基因的检测方法，检测步骤包括：(1)待测样本DNA的提取；(2)以步骤(1)提取到的DNA为模板，选用上述转基因抗除草剂外源bar基因或pat基因的LAMP引物或试剂盒进行LAMP反应；(3)LAMP扩增产物分析：有扩增信号，则待测样本中含有与所用引物或试剂盒对应的相关基因成分；无扩增信号，则待测样本中不含相对应相关基因成分。本专利技术所述的基于LAMP技术的转基因抗除草剂外源bar基因或pat基因检测方法的LAMP反应可以采用基础扩增反应体系(包括LAMP外引物、内引物、DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、10xLAMP反应缓冲液、去离子水)或加速扩增反应体系(包括LAMP外引物、内引物、环引物、DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、10xLAMP反应缓冲液、去离子水)。上述基础扩增反应体系，优选为：当加入利用实时荧光报告系统时，荧光染料SYBRGreenI加入的浓度为1/50000；当利用比色分析报告体系时，pH指示剂中性红加入的浓度为100μmol/L；最后用ddH2O补足至25μL。上述加速扩增反应体系，优选为：当加入利用实时荧光报告系统时，荧光染料SYBRGreenI加入的浓度为1/50000；当利用比色分析报告体系时，pH指示剂中性红加入的浓度为100μmol/L；最后用ddH2O补足至25μL。本专利技术基于LAMP技术检测转基因抗除草剂外源bar或pat基因的检测试剂盒、检测方法以肉眼可见的比色信号指示结果时，信号报告分子是中性红时，黄色为阴性结果，粉红色为阳性结果。如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。“DNA”：脱氧核糖核酸。是一类带本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于LAMP技术的转基因抗除草剂外源bar基因的特异性LAMP引物，其特征是：根据转基因抗除草剂外源bar基因特异性设计。/n
【技术特征摘要】
1.基于LAMP技术的转基因抗除草剂外源bar基因的特异性LAMP引物，其特征是：根据转基因抗除草剂外源bar基因特异性设计。
2.根据权利要求1所述的转基因抗除草剂外源bar基因的特异性LAMP引物，其特征是：包括外引物、内引物、环引物，优选为：
外引物barB3：AGGTGGACGGCGAGGT
外引物barF3：TGCATGCGCACGCTC
内引物barBIP：TGGCGGGGGGAGACGTACAGGGTCCCTGGAAGGCA
内引物barFIP：TGCTGAAGTCCCTGGAGGCACAGTTGGGCAGCCCGATG
环引物barLB：CGGTTGACTCGGCCGTCCAGTCGTAGGCGTTGCG
环引物barLF：GGGCTTCAAGAGCGTGGTCGCTGT。
3.基于LAMP技术检测转基因抗除草剂外源bar基因的基础检测试剂盒，其特征是：包括权利要求2所述LAMP外引物、内引物。
4.基于LAMP技术检测转基因抗除草剂外源bar基因的加速检测试剂盒，其特征是：包括权利要求2所述LAMP外引物、内引物、环引物。
5.基于LAMP技术的转基因抗除草剂外源pat基因的特异性LAMP引物，其特征是：根据转基因抗除草剂外源pat基因特异性设计。
6.根据权利要求5所述的转基因抗除草剂外源pat基因的特异性LAMP引物，其特征是：包括外引物、内引物、环引物，优选为：
外引物patB3：GGTAACTGGCCTAACTGGC
外引物patF3：GGCGCAAGGTTTTAAGTCTG
内引物patBIP：ATTGCGCGCAGCTGGATACAA-GGAGGAGCTGGCAACTCA
内引物patFIP：TACCCCGGGCTGTGTATCCC-ATAGGCCTTCCAAACGATCC
环引物patLB：GCATGGTGGATGGCATGATGTTGGTTTTTGGCAAAGGGA
环引物patLF：AAGCCTCATGCAACCTAACAGAT。
7.基于LAMP技术检测转基因抗除草剂外源pat基因的基础检测试剂盒，其特征是：包括权利要求6所述LAMP外引物、内引物。
8.基于LAMP技术检测转基因抗除草剂外源pat基因的加速检测试剂盒，其特征是：包括权利要求6所述LAMP外引物、内引物、环引物。
9.根据权利要求3或4或7或8所述的检测试剂盒，其特征是：还包括DNA聚合酶、dNTPs、10xLAMP反应缓冲液、去离子水。
10.根据权利要求3或4或7或8所述的检测试剂盒，其特征是：还可以包括信号报告分子用于指示检测结果，以荧光信号指示结果时，信号报告分子可以是荧光分子如SYBRGreenI；以肉眼可见的比色信号指示结果时，信号报告分子可以是羟基萘酚蓝或中性红。
11...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐卓，董娟，王嘉钰，陈刚毅，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51
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