利用PCR-RFLP检测绵羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了利用PCR‑RFLP检测绵羊

Detection of single nucleotide polymorphism of DAZL gene in sheep by PCR-RFLP and its application

【技术实现步骤摘要】
利用PCR-RFLP检测绵羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法及其应用
本专利技术涉及基因检测领域，具体是利用PCR-RFLP检测绵羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法及其应用。
技术介绍
在动物育种中，人们期望通过对生长、繁殖等性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。分子育种，即分子标记辅助选择育种(MolecularMark-AssistSelection，MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要是包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander(1996)提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。SNP是基因组中存在的一种数量非常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的90％以上。SNP与罕见的变异不同，通常在种群中频率等于或小于1％的此种变异被称为突变，而只有频率大于1％时才被称为单核苷酸多态性。它的变异形式有：颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。根据基因组中单核苷酸多态性产生的位置，可分为以下3类：基因编码区单核苷酸多态性(Coding-regionSNPs，cSNPs)、基因周边单核苷酸多态性(PerigenicSNPs，pSNPs)以及基因间单核苷酸多态性(IntergenicSNPs，iSNPs)。研究表明，位于编码区内的cSNP比较少，由于它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此，编码区内的cSNP的研究更受关注。基因编码区内的cSNP又可分为2种：一种是编码区内的同义cSNP(SynonymouscSNP)，即SNP所致编码序列的改变并不会影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列的改变；另一种是编码区内的非同义cSNP(Non-SynonymouscSNP)，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而导致蛋白质中氨基酸序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、聚合酶链反应—单链构象多态(PolymeraseChainReaction-SingleStrandConformationPolymorphism，PCR-SSCP)与DNA测序结合法、等位特异性PCR(AlleleSpecificPCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因型，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。本研究检测基因SNPs所使用的限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(RestrictionFragmentLengthPolymorphism-PolymeraseChainReaction，RFLP-PCR)方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后设计上下游引物用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。DAZL(DeletedinAZoospermiaLike)是DAZ基因家族(包括DAZ，DAZL，和BOULE)中重要的一员，最早克隆于蝇类的睾丸组织，只一个高度保守的基因。DAZL定位于脊椎动物的常染色体，其蛋白是一个RNA结合蛋白，通过RNA识别基序与mRNA结合，并以多聚体的方式参与mRNA的翻译起始，是人类生殖细胞形成所必须的调控因子。DAZ基因编码了具8～24次重复、每个重复的DAZ区含24个氨基酸残基的几种异构体。DAZLA蛋白仅包含单个DAZ重复单位，而DAZL和BOULE广泛存在于哺乳动物。据推测BOULE是DAZ家族的祖先，DAZL源于BOULE，DAZ源于DAZL。DAZL与DAZ基因结构同源性占83％，不仅表现在编码序列，而且也表现在启动子区和内含子，二者与BOULE的差别比较大。它们所编码的两种RNA结合蛋白仅在睾丸或卵巢中表达，尽管这两个蛋白在细胞内定位不同，但都存在于胎儿生殖母细胞核、细胞质和精原细胞核中。DAZL在生殖细胞发育早期开始表达，在配子生成的减数分裂过程中持续存在，是蝇类精子发生所必须的。有研究发现，DAZL是进入生殖细胞减数分裂期的重要内在因素。DAZL参与精子生成过程中减数分裂前的有丝分裂增殖期、精原细胞的发育、细线期到偶线期转换等过程。Ruggiu等通过小鼠实验发现，杂合子的DAZL基因突变可以增加畸形精子的发生率，推测精子形成中DAZL可能主要涉及长兴精子细胞的形成和成熟游动精子的形态改变。小鼠DAZL基因的丢失会导致A型精原细胞向A1型精原细胞的发育停滞，雌性小鼠则会出现卵子不能生成或严重缺少的症状，而DAZL基因敲除小鼠，转人类DAZL基因后可产生大量的早期生殖细胞。在精子发生障碍的人睾丸中DAZL转录本的数量水平显著降低。因此，可以看出DAZL基因是配子生成过程中的调控因子。DAZL蛋白在细胞质中与多聚腺苷酸结合蛋白(polyA-bindingproteins，RABPs)共同调控配子生成过程mRNAs翻译起始。DAZL蛋白的RNA靶点可能包括多个DAZL-连接序列。在生殖细胞发育过程中DAZL蛋白对mRNA的特定区域的翻译起促进作用。
技术实现思路
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【技术保护点】
1.利用PCR-RFLP检测绵羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：包括利用PCR-RFLP检测绵羊DAZL基因第26750位为G或A的单核苷酸多态性的检测方法。/n

【技术特征摘要】
1.利用PCR-RFLP检测绵羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：包括利用PCR-RFLP检测绵羊DAZL基因第26750位为G或A的单核苷酸多态性的检测方法。


2.根据权利要求1所述的利用PCR-RFLP检测绵羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：
S1采集湖羊睾丸屠宰的睾丸组织，经过液氮环境保存后，再经过研磨成粉，将得到的粉末中取0.1g置于1000μLDNA抽提缓冲液，并经过在55℃下的蛋白酶K处理，取反应后溶液经过Tris-饱和酚处理得到DNA提取液；
S2将所述的DNA提取液经过琼脂糖凝胶电泳检测，选择电泳结果中条带均一、无拖尾和无降解的DNA提取液，稀释至50ng/μL后，在20个浓度为50ng/μLDNA样品中，分别取10μL混合构建成品种DNA池；
S3将所述的品种DNA池中，采用混合加样法以特异性引物对P进行PCR扩增，得到多个DNA样品片段，将所述的多个DNA样品片段采用限制性内切酶AluI消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，将得到的多个DNA样品小分子进行切胶回收及纯化，得到纯化DNA；所述的特异性引物对P为：
上游引物：5’-AGTTTGGAGTCTCAGGATTT-3’20nt，
下游引物：5’-GCATGATGTACTCTGTGTAG-3’20nt；
S4针对所述纯化DNA进行凝胶成像，判定其基因型，确定纯化DNA的基因型；将所述纯化DNA进行双向测序，判定绵羊DAZL基因第26750位的单核苷酸多态性，得到绵羊DAZL基因第26750位的单核苷酸多态性分布情况。


3.根据权利要求2所述的利用PCR-RFLP检测绵羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述S2中稀释步骤前可将选取的DNA提取液通过吸光度检测判定是否需要纯化处理。


4.根据权利要求3所述的利用PCR-RFLP检测绵羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述的通过吸光度检测判定为：测定DNA提取液在260nm、280nm的紫外光下的OD值，计算DNA含量和OD260/OD280的比值；当OD260/OD280的比值小于1.6时，进行纯化处理；当OD260/OD280的比值大于1.8时，进行去除RNA的纯化。


5.根据权利要求4所述的利用PCR-RFLP检测绵羊DAZL基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述的计算DNA含量公式为：
DNA浓度(ng/μL)＝50×OD260值×稀释倍数。

【专利技术属性】
技术研发人员：乐祥鹏，罗静，秦芳，李发弟，李万宏，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62