一种生产和提取色氨酸的工艺制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种生产和提取色氨酸的工艺，其包括发酵工序和提取工序。本发明专利技术对生产工艺进行了进一步改进，在提高色氨酸产量的同时，保证了流加效果；采用膜技术进行改进色氨酸发酵液传统提取工艺，通过脱色膜去除发酵液中的菌体蛋白，澄清发酵液；通过脱色膜分级去除大分子蛋白和色素，最后采用浓缩膜在常温无相变下进行浓缩。

A process for production and extraction of tryptophan

【技术实现步骤摘要】
一种生产和提取色氨酸的工艺
本专利技术属于生物
，具体涉及一种生产和提取色氨酸的工艺。
技术介绍
L-色氨酸的分子式为C11H12O2N2，分子量为204.21，含氮13.72％。L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈绢丝光泽、六角片状自色晶体，无臭，有甜味。在水中溶解度1.14g/L(25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸，广泛应用于饲料行业中。色氨酸的生产方法先后经历了蛋白质水解法、化学合成法和微生物法三种方法，其中微生物法又包括直接发酵法、微生物转化法和酶法。目前，色氨酸发酵企业大多采用分批补料发酵方式。这种方式对发酵液中残留葡萄糖浓度控制和补入糖(包括葡萄糖和液糖)的分散程度要求较高。残留葡萄糖浓度若要控制的不当，就会影响到菌体的正常代谢，使菌体的代谢途径发生变化，严重影响色氨酸的发酵水平和产量，甚至会导致无色氨酸产生。所以，培养基中营养物质对菌体的生长和代谢产物的产生起着决定作用。色氨酸的传统提取工艺复杂，其工艺流程为：发酵液，板框过滤，真空浓缩，粗结晶，离心，粗品，活性炭脱色，再结晶，离心，干燥，包装粉碎。在这个过程中，板框过滤需加硅藻土填料，脱色率为80％，滤渣的回收价值低二次结晶的母液浑浊，难回收真空浓缩容易局部温度过高而破坏有效成份以及增加产品色素，能耗高。由于上述几个方面，导致色氨酸提取工艺的整体收率在75％以下，提取工艺成本高，其工艺急需加以改进。
技术实现思路
为解决上述问题，克服现有技术的不足之处，本专利技术对生产工艺进行了进一步改进，在提高色氨酸产量的同时，保证了流加效果。采用膜技术进行改进色氨酸发酵液传统提取工艺，通过脱色膜去除发酵液中的菌体蛋白，澄清发酵液；通过脱色膜分级去除大分子蛋白和色素，最后采用浓缩膜在常温无相变下进行浓缩。本专利技术的目的是通过下述技术方案实现的：一种生产和提取色氨酸的工艺，其包括发酵工序和提取工序；所述发酵工序包括如下步骤：将产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌种子液以1%-10%接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养40h，得到发酵液；所述提取工序包括如下步骤：发酵液进行灭菌，经陶瓷膜过滤得到滤液；将滤液泵入色谱系统，进行L-色氨酸和其他杂质的分离；然后通过脱色膜，过滤除去色素和蛋白，收集脱色液；将所得脱色液进行反渗透膜脱水浓缩，得到L-色氨酸洗脱液，将其打入四效蒸发器，真空浓缩为原体积的四分之一，所得浓缩液进行冷却结晶，离心、烘干得到L-色氨酸产品。进一步地，所述发酵培养的参数为：转速300-500rpm，温度35-37℃，罐压0.05-0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5-6.8，流加浓度为400-500g/l葡萄糖溶液控制残糖浓度为1-1.5g/L，溶氧量：在0-12h控制在25-30%，在13-40h控制在15-20%。进一步地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L、大豆蛋白胨5g/L、磷酸氢二钾9g/L、柠檬酸3.5g/L、硫酸铵3.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁20mg/L、一水硫酸锰10mg/L、生物素0.1mg/L。进一步地，所述发酵工序中，通过流加培养液来提高色氨酸产量，具体包括如下：1）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以1.0-3.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加磷酸氢二钾溶液，直至发酵结束；2）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以0.5-1.5ml/h的流速往发酵罐中补料流加硫酸铵溶液，直至发酵结束；3）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以1.0-2.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加精氨酸水溶液，直至发酵结束；4）在发酵培养30h左右，于每升发酵液中以2.0-4.0ml/h的流速往发酵罐中补料流加丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液，直至发酵结束。优选地，所述磷酸氢二钾溶液的浓度为5.0%（w/v）。优选地，所述硫酸铵溶液的浓度为10.0%（w/v）。优选地，所述精氨酸水溶液的浓度为5.0%（w/v）。优选地，所述丙二酸和三氟乙酸的混合水溶液中，丙二酸的浓度为10-20%（v/v），三氟乙酸的浓度为10-20%（v/v）。优选地，所述陶瓷膜为Al2O3微滤膜，截留分子量为5000Da。优选地，所述反渗透膜为聚酰胺复合膜，压力为0.55MPa，温度为55℃。本专利技术的技术方案具有以下突出优点及独特性：本专利技术发酵培养基中采用蛋白胨替代酵母膏作为迟效氮源，杂蛋白、色素等复杂不稳定物质降低，并且添加量较少，微生物生长通过迟效氮源，以及流加速效氮源来维持，发酵培养基相对较为清洁，菌体代谢所产生的能量循环与传递通畅，多数能量供应自身生长需求，较少生成乙酸；控制葡萄糖的摄入速率对L-色氨酸发酵具有重要意义。发酵初期葡萄糖浓度过高，会造成乙酸产量增加，但是浓度过低不利于菌株增殖；发酵中后期保持较低葡萄糖的摄入速率有利于抑制乙酸等副产物的生成，过高葡萄糖的摄入速率使TCA循环代谢流增加，HMP途径流量不充足。本专利技术采用发酵前期相对较高葡萄糖浓度，发酵中后期葡萄糖浓度控制在较低水平，以达到控制乙酸生长，并且保持菌株增殖效率的目的。本专利技术通过在发酵后期流加磷酸氢二钾以及硫酸铵，有效补充了氮源以及菌株生长所需要的营养物质，维持了菌株的生长活力，发酵产酸性能大幅提升；发酵中后期，代谢副产物增多，添加适量的精氨酸可提高6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活力，降低代谢副产物的积累量，从而进一步提高L-色氨酸的产率。丙二酸和三氟乙酸能够抑制TCA循环的关键酶，进而减弱TCA循环，增加非氧化磷酸戊糖循环的流量，减少了TCA循环中乙酸等副产物的生成量，进一步增加了L-色氨酸的产率；但是TCA循环也不易过度弱化，因为，过度弱化会造成菌株生长受到明显抑制，从而造成L-色氨酸的产量下降。本专利技术补入的糖能够快速均匀分布到发酵液中，有效的解决了糖局部浓度过高造成发酵液渗透压过和过多的副产物乙酸;同时也解决了发酵液中局部葡萄糖浓度过低而使底物限制，使发酵液中的残糖迅速耗尽，导致菌种生产能力不能得到最大限度发挥的问题；在溶氧回升前，通过调整搅拌转速或者空气流量，将溶氧维持在较高的水平，解氧回升后按固定时间间隔调整搅拌转速或者空气流量，同时增加补糖速率，在发酵前期(0〜12h)和发酵后期（13h〜培养结束)将溶解氧控制在不同的水平，这一方面加快了菌种的生长速率，另一方面避免了工艺参数调整过快，糖补入量过多，造成发酵失控；本专利技术提取工艺中，膜分离的过程是一个高效、环保的分离过程，它是多学科交叉的高新技术，它在物理、化学和生物性质上可呈现出各种各样的特性，具有较多的优势；本专利技术采用膜分离技术改进色氨酸传统提取工艺，色氨酸整体收率大幅提高，能耗降本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产和提取色氨酸的工艺，其包括发酵工序和提取工序；/n所述发酵工序包括如下步骤：将产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌种子液以1%-10%接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养40h，得到发酵液；/n所述提取工序包括如下步骤：发酵液进行灭菌，经陶瓷膜过滤得到滤液；将滤液泵入色谱系统，进行L-色氨酸和其他杂质的分离；然后通过脱色膜，过滤除去色素和蛋白，收集脱色液；将所得脱色液进行反渗透膜脱水浓缩，得到L-色氨酸洗脱液，将其打入四效蒸发器，真空浓缩为原体积的四分之一，所得浓缩液进行冷却结晶，离心、烘干得到L-色氨酸产品。/n

【技术特征摘要】
1.一种生产和提取色氨酸的工艺，其包括发酵工序和提取工序；
所述发酵工序包括如下步骤：将产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌种子液以1%-10%接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养40h，得到发酵液；
所述提取工序包括如下步骤：发酵液进行灭菌，经陶瓷膜过滤得到滤液；将滤液泵入色谱系统，进行L-色氨酸和其他杂质的分离；然后通过脱色膜，过滤除去色素和蛋白，收集脱色液；将所得脱色液进行反渗透膜脱水浓缩，得到L-色氨酸洗脱液，将其打入四效蒸发器，真空浓缩为原体积的四分之一，所得浓缩液进行冷却结晶，离心、烘干得到L-色氨酸产品。


2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养的参数为：转速300-500rpm，温度35-37℃，罐压0.05-0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5-6.8，流加浓度为400-500g/l葡萄糖溶液控制残糖浓度为1-1.5g/L，溶氧量：在0-12h控制在25-30%，在13-40h控制在15-20%。


3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L、大豆蛋白胨5g/L、磷酸氢二钾9g/L、柠檬酸3.5g/L、硫酸铵3.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁20mg/L、一水硫酸锰10mg/L、生物素0.1mg/L。


4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵工序中，通过流加培养液来提高色氨酸产量，具体包括如下：

【专利技术属性】
技术研发人员：张宗华，边恩来，赵仁楷，王飞，韩富江，
申请(专利权)人：冯世红，
类型：发明
国别省市：新疆;65