水稻生长素糖基转移酶基因的应用制造技术

本发明专利技术公开了生长素糖基转移酶基因的应用。所述的基因OsIAGLU核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，以及编码相应的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术在水稻中首次报道了OsIAGLU基因能调控水稻种子活力，通过试验表明突变该基因影响正常条件种子萌发及幼苗建成能力。证明本发明专利技术OsIAGLU基因调控了水稻种子活力，利用该基因有助于筛选和培育高种子活力水稻品种，有利于直播稻生产。

Application of rice auxin glycosyltransferase gene

【技术实现步骤摘要】
水稻生长素糖基转移酶基因的应用
本专利技术属于种子生物
，涉及水稻生长素糖基转移酶基因的应用。
技术介绍
水稻(OryzasativaL.)是我国栽培历史最悠久的粮食作物之一。近年来，随着经济的发展，农村劳动力日益短缺，直播稻生产变得越来越普遍。直播稻生产对种子播种质量要求高，种子质量差会导致种子发芽速度慢、田间成苗率低、幼苗长势参差不齐，甚至会严重影响作物产量。生长素是调控植物生长发育的重要因子，有关生长素糖基转移酶基因调控水稻种子萌发与幼苗生长的研究少有报道，有关利用生长素糖基转移酶基因筛选和培育高活力水稻品种的应用未有报道。因此，利用参与水稻种子萌发与幼苗生长调控的生长素糖基转移酶基因OsIAGLU，对筛选和培育高活力水稻品种提供帮助，对直播稻生产具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一个控制水稻种子萌发与幼苗生长的生长素糖基转移酶基因OsIAGLU的分离克隆、功能验证和应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：一个来自水稻生长素糖基转移酶基因OsIAGLU，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的水稻生长素糖基转移酶基因OsIAGLU编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术所述的水稻OsIAGLU基因或蛋白在筛选或培育高种子活力水稻品种中的应用。本专利技术所述的水稻OsIAGLU基因突变体获得和基因功能验证，包括如下步骤：(1)获得水稻OsIAGLU基因的核苷酸序列及氨基酸序列；(2)设计靶位点及其引物，以pCBC-MT1T2为模板进行PCR扩增，纯化回收PCR产物，获得MT1T2-PCR载体；(3)将步骤(2)得到的带有OsIAGLU基因的目标片段的MT1T2-PCR胶回收产物构建到pHUE411载体上，获得pHUE411+MT1T2-PCR载体；(4)将步骤(3)得到的带有OsIAGLU基因目标片段的质粒转化农杆菌；将带有转化质粒的农杆菌转化水稻；(5)水稻突变体筛选与鉴定，并在正常条件下鉴定种子活力。进一步的，在步骤(1)中利用水稻cDNA为模板PCR克隆出该基因的引物序列，所述PCR的上游引物序列如SEQIDNO.3所示，下游引物序列如SEQIDNO.4所示。进一步的，在步骤(2)中构建的水稻OsIAGLUCRISPR/Cas9突变体gRNA靶序列(OsIAGLU基因中19bp的目标片段)如序列表SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示；以pCBC-MT1T2为模板进行PCR扩增的引物序列如序列表SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10所示；在步骤(3)中，用BsaI酶切pHUE411载体，利用同源重组法获得pHUE411+MT1T2-PCR载体。在步骤(5)中，筛选纯合突变体所用上游引物序列如SEQIDNO.11所示，下游引物序列如SEQIDNO.12所示。水稻种子活力鉴定包括正常条件下种子发芽、幼苗生长。本专利技术所述的一种检测种子萌发期OsIAGLU基因表达水平的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)取不同萌发期水稻种子；(2)用TransZolPlantkit(Transgen,www.transgen.com)试剂盒提取各个样的RNA；(3)用IIReverseTranscriptasesystem(VazymeBiotechCo.,Ltd)试剂盒反转录形成cDNA，以其为模板；(4)用荧光定量PCR进行分析，荧光定量PCR检测引物序列，所述上游引物序列如序列表SEQIDNO.13所示，所述下游引物序列如序列表SEQIDNO.14所示。进一步的，在步骤(1)中水稻种子在10mL蒸馏水培养皿中25℃条件下培养，分别在吸胀0、4、12、24、36、48、60、72h后取样；种子经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末，样品贮存于-80℃，每个时间点取样三份。在步骤(4)中，采用水稻内参基因OsActin引物，所述上游引物的序列如序列表SEQIDNO.15所示，所述下游引物的序列如序列表SEQIDNO.16所示。有益效果：本专利技术从水稻中分离克隆了OsIAGLU基因，并鉴定了该基因在种子活力调控方面的功能，对于高活力水稻品种筛选或育种具有重要意义。本专利技术具有如下优点：(1)本专利技术从水稻中分离、克隆获得OsIAGLU基因，通过构建CRISPR/Cas9突变体首次证明了该基因参与水稻种子活力调控。(2)本专利技术为筛选高种子活力水稻品种提供了基础，也为改良提高水稻种子活力提供了重要的基因资源，对直播稻生产具有重要意义。附图说明图1：水稻OsIAGLU突变体在正常条件下的种子活力表现图2：水稻OsIAGLU基因在种子萌发过程中的表达情况具体实施方式本专利技术结合附图和具体实施例作进一步说明，实施例中所用方法无特别说明均为常规方法，所用引物、测序由广州天一辉远基因科技有限公司完成；实验中用到的各种限制性内切酶、连接酶、DNAMarker、TagDNA聚合酶、dNTPs等购自广州硕恒生物科技有限公司；反转录试剂盒购于诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒以及基因组提取试剂盒购于美基生物科技有限公司，方法均参照说明书进行。实施例1：基因克隆利用粳稻品种日本晴cDNA为模板PCR克隆出OsIAGLU基因的序列，PCR的上游引物序列如SEQIDNO.3所示，下游引物序列如SEQIDNO.4所示。获得水稻OsIAGLU基因的核苷酸序列及氨基酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列SEQIDNO.2所示。实施例2：突变体构建登录到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，筛选靶点。靶点序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6，以靶点序列设计引物，引物序列如SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10所示。以pCBC-MT1T2为模板进行四引物PCR扩增，纯化回收PCR产物，获得MT1T2-PCR载体。用BsaI酶切pHUE411载体，利用同源重组法获得pHUE411+MT1T2-PCR载体。得到的pHUE411+MT1T2-PCR载体转化农杆菌；将带有转化质粒的农杆菌转化野生型的粳稻品种日本晴；利用PCR扩增产物测序，与野生型比对，筛选纯合突变体，所用上游引物如SEQIDNO.11所示，下游引物如SEQIDNO.12所示。实施例3：基因突变体表型分析利用实施例2构建成功的OsIAGLUCRISPR/Cas9突变体osiaglu-1、osiaglu-2、osiaglu-3种子，以及野生型日本晴(WT)水稻品种，进行种子发芽试验。具体方法如下：每次重复挑选健康饱满的种子50粒，用0.1％的氯化汞溶液表面消毒5min本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.水稻生长素糖基转移酶基因OsIAGLU在筛选或培育高种子活力水稻品种中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.水稻生长素糖基转移酶基因OsIAGLU在筛选或培育高种子活力水稻品种中的应用。


2....

【专利技术属性】
技术研发人员：王州飞，何永奇，赵佳，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44