一种用于培养结直肠癌实体瘤原代细胞的培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种用于培养结直肠癌实体瘤原代细胞的培养基。本发明专利技术提供了一种结直肠癌实体瘤原代细胞培养方法及配套试剂，本发明专利技术配制特殊的无血清培养基，利用悬浮培养体系对结直肠癌实体瘤来源的肿瘤细胞进行体外培养，保证癌细胞正常扩增的同时最大限度的排除正常细胞的干扰。利用本发明专利技术方法得到的结直肠癌原代细胞培养物可以用于多种细胞水平的体外实验、二代测序、构建动物模型、构建细胞系等等。可以预见，这种培养方法及本发明专利技术所提供的特殊培养基在结直肠癌的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于培养结直肠癌实体瘤原代细胞的培养基
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于培养结直肠癌实体瘤原代细胞的培养基。
技术介绍
结直肠癌是最常见的严重威胁人类的健康恶性肿瘤之一。在我国结直肠癌的发病率为9.24％，在所有恶性肿瘤中占第四位。而结直肠癌的死亡率为11.77％，在全部恶性肿瘤中占第五位。随着经济的发展、生活水平的提高和生活方式的改变，结直肠癌的发病率还将呈不断上升的趋势。另外，结直肠癌复发转移风险高，超过50％的结直肠癌患者会在根治性治疗后数月到数年内出现不同程度的复发转移。尽管世界各国的科研和医疗机构对结直肠癌的病因以及发生发展过程的研究都有很大力度的投入，但是人类对这种疾病仍然知之甚少。结直肠癌是一种复杂疾病，其发生、发展是一个动态的过程，涉及到诸多信号分子相互作用，形成了一个复杂的分子调控网络，同时还受到外界环境因素的影响。结直肠癌的病因和发生发展过程有很强的个体差异性，不能一概而论。因此将结直肠癌实体瘤原代细胞培养物作为模型进行个体化精准研究是结直肠癌研究领域乃至结直肠癌诊断治疗领域的趋势。现有的原代肿瘤细胞培养技术主要有2D培养，3D培养，重编程培养等几类，这些方法都不同程度的面临培养周期极长，培养成功率低，杂细胞难以去除等问题。
技术实现思路
为了有效解决上述技术问题，本专利技术提供了一种新的结直肠癌实体瘤原代细胞培养技术及配套试剂，本专利技术配制特殊的无血清培养基，利用悬浮培养体系对结直肠癌实体瘤来源的肿瘤细胞进行体外培养，保证癌细胞正常扩增的同时最大限度的排除正常细胞的干扰。第一方面，本专利技术要求保护一种用于培养结直肠癌实体瘤原代细胞的培养基。本专利技术所提供的用于培养结直肠癌实体瘤原代细胞的培养基由抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白Wnt-3a、人重组蛋白R-spondin、SB202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)、A83-01(3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide)、PrimocinTM、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)、烟碱(Nicotinamide)、N-2Supplement、霍乱毒素(CholeraToxin)、B27、ITS-X(Insulin,Transferrin,Selenium,EthanolamineSolution)、Y-27632和AdvancedDMEM/F12培养基组成。其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B的终浓度为250-250ng/mL(如250ng/mL)；所述HEPES的终浓度为8-12mM(如10mM)；所述GlutaMax的终浓度为0.8-1.2％(如1％，％表示体积百分含量)；所述人重组蛋白EGF的终浓度为10-100ng/mL；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白Wnt-3a的终浓度为200-300ng/mL；所述人重组蛋白R-spondin的终浓度为250-500ng/mL；所述SB202190的终浓度为5-10μM；所述A83-01的终浓度为0.25-1.25μM；所述PrimocinTM的终浓度为如1％(体积百分含量)；所述N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)的终浓度为0.5-2mM；所述烟碱(Nicotinamide)的终浓度为5-10mM；所述N-2Supplement的终浓度为1％(体积百分含量)；所述霍乱毒素(CholeraToxin)的终浓度为0.1-1nM；所述B27的终浓度为1.5-2.5％(如2％，％表示体积百分含量)；所述ITS-X的终浓度为0.8-1.2％(如1％，％表示体积百分含量)；所述Y-27632的终浓度为5-20μM；余量均为AdvancedDMEM/F12培养基。以上各物质的终浓度均为在所述用于培养结直肠癌实体瘤原代细胞的培养基中的终浓度。进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B。所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)为“Antibiotic-Antimycotic,100X”(如Gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品)。所述“Antibiotic-Antimycotic,100X”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B，利用0.85％盐液形式的青霉素G(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素B作为抗真菌剂。所述GlutaMAX为“GlutaMAXTMSupplement”(如Gibco#35050061，或与其组成相同的其他产品)。所述“GlutaMAXTMSupplement”的成分为L-alanyl-L-glutamine，是L-glutamine的替代物，浓度为200nM，溶剂为0.85％NaCl溶液。所述PrimocinTM为原代细胞用抗菌剂(如Invivogene#ant-pm-1，或与其组成相同的其他产品)，用于保护原代细胞免受微生物污染的抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌均有杀伤作用。所述N-2Supplement为“N-2Supplement(100X)”(如Gibco#17502001，或与其组成相同的其他产品)。所述“N-2Supplement(100X)”中含有终浓度为1mM的人全铁转铁蛋白(HumanTransferrin(Holo))、500mg/L的重组胰岛素全链(InsulinRecombinantFullChain)、0.63mg/L的孕酮(Progesterone)、10mM的腐胺(Putrescine)、0.52mg/L的亚硒酸盐(Selenite)。所述B27为“B-27TMSupplement(50X),minusvitaminA”(如Gibco#12587010，或与其组成相同的其他产品)。所述“B-27TMSupplement(50X),minusvitaminA”中含有生物素(Biotin)、DL-α-生育酚乙酸酯(DLAlphaTocopherolAcetate)、DL-α-生育酚(DLAlpha-Tocopherol)、BSA(fattyacidfreeFractionV)、过氧化氢酶(Catalase)、人重组胰岛素(HumanRecombinantInsulin)、人转铁蛋白(HumanTransferrin)、超氧化物歧化酶(Superoxi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于培养结直肠癌实体瘤原代细胞的培养基，其特征在于：所述培养基由抗菌抗真菌剂三抗、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白Wnt-3a、人重组蛋白Noggin、SB202190、A83-01、Primocin

【技术特征摘要】
1.一种用于培养结直肠癌实体瘤原代细胞的培养基，其特征在于：所述培养基由抗菌抗真菌剂三抗、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白Wnt-3a、人重组蛋白Noggin、SB202190、A83-01、PrimocinTM、N-乙酰-L-半胱氨酸、烟碱、N-2Supplement、皮质醇、B27、ITS-X、Y-27632和AdvancedDMEM/F12培养基组成；
其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B的终浓度为250-250ng/mL；所述HEPES的终浓度为8-12mM；所述GlutaMax的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量)；所述人重组蛋白EGF的终浓度为10-100ng/mL；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白Wnt-3a的终浓度为200-300ng/mL；所述人重组蛋白R-spondin的终浓度为250-500ng/mL；所述SB202190的终浓度为5-10μM；所述A83-01的终浓度为0.25-1.25μM；所述PrimocinTM的终浓度为1％(体积百分含量)；所述N-乙酰-L-半胱氨酸的终浓度为0.5-2mM；所述烟碱的终浓度为5-10mM；所述N-2Supplement的终浓度为1％(体积百分含量)；所述霍乱毒素(CholeraToxin)的终浓度为0.1-1nM；所述B27的终浓度为1.5-2.5％(体积百分含量)；所述ITS-X的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量)；所述Y-27632的终浓度为5-20μM；余量均为AdvancedDMEM/F12培养基。


2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基为由所述抗菌抗真菌剂三抗、所述HEPES、所述GlutaMax、所述人重组蛋白EGF、所述人重组蛋白bFGF、所述人重组蛋白HGF、所述人重组蛋白Wnt-3a、所述人重组蛋白R-spondin、所述SB202190、所述A83-01、所述PrimocinTM、所述N-乙酰-L-半胱氨酸、所述烟碱、所述N-2Supplement、所述霍乱毒素、所述B27、所述ITS-X、所述Y-27632和所述AdvancedDMEM/F12培养基混合而成的溶液。


3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基中的各组分单独存在。


4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白Wnt-3a、人重组蛋白R-spondin、SB202190、A83-01、N-乙酰-L-半胱氨酸、烟碱、霍乱毒素和Y-27632以母液形式存在；
具体的，所述母液为1000-100000倍母液；
1000×人重组蛋白EGF储液由人重组蛋白EGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白EGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS；
1000×人重组蛋白bFGF储液由人重组蛋白bFGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白bFGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS；
1000×人重组蛋白HGF储液由人重组蛋白HGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白HGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS；
1000×人重组蛋白Wnt-3a储液由人重组蛋白Wnt-3a、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白Wnt-3a的终浓度为200μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS；
1000×人重组蛋白R-spondin储液由人...

【专利技术属性】
技术研发人员：张函槊，尹申意，
申请(专利权)人：北京吉尚立德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11