地衣芽孢杆菌BL3的Sir2样蛋白制备、纯化及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有去乙酰化酶活性且依赖于NAD

Preparation, purification and application of Sir2 like protein from Bacillus licheniformis BL3

【技术实现步骤摘要】
地衣芽孢杆菌BL3的Sir2样蛋白制备、纯化及应用
本专利技术属菌种蛋白活性筛选和应用机制的生物
，更具体地说，本专利技术涉及一种具有去乙酰化酶活性且依赖于NAD+的地衣芽孢杆菌BL3的Sir2样蛋白的制备、纯化及其应用。
技术介绍
Sir2蛋白家族（Sirtuin）是一种保守蛋白，它主要作为NAD+依赖性蛋白去乙酰化酶，其存在于包括古细菌到哺乳动物各种生物中。研究表明，Sirtuins广泛参与调节机体能量代谢调节，保持机体糖脂代谢稳态，其中以SIRT1、SIRT3、SIRT6研究的最为广泛。SIRT1是该家族研究最多的一个成员，当前的研究已经表明其不但可以调控组蛋白的去乙酰化作用，而且还对非组蛋白也有很好的调节作用。在体内和体外SIRT1可通过PGC-1α转录因子来调节糖异生、糖酵解，导致线粒体数量和功能的增加。另外有研究表明，SIRT1可以改善线粒体功能障碍，当过表达SIRT1时改善高糖诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗，进一步研究发现这是通过调节SIRT1-SIRT3-线粒体的途径来实现的。在肌肉中，SIRT1能够通过去乙酰化PGC1-α来增强线粒体中的脂肪酸氧化。另外SIRT3是最主要的一种线粒体去乙酰化酶，它的很多靶蛋白已被确定，其中有许多参与调节重要的代谢平衡。此外，SIRT3去乙酰化复合体I、II、III，它们参与氧化磷酸化（OXPHOS），线粒体有氧呼吸的最后阶段。在HEK293T细胞内过表达线粒体sirtuin蛋白改变糖酵解和线粒体功能。其次，SIRT6参与基因组DNA的稳定和修复代谢和衰老的作用。已有研究表示SIRT6缺失小鼠会出现低血糖症状，而在SIRT6缺失的细胞中葡萄糖摄取增加，糖酵解增强而线粒体呼吸功能减弱。总结以上研究，不难发现Sirtuin蛋白与细胞能量代谢密切相关，而且在一定程度上它们充当着糖酵解到氧化代谢的开关。越来越多的研究表示益生菌可以改善代谢等疾病。益生菌中具有Sir2同源蛋白，但关于Sir2蛋白在益生菌中的生物学功能少有报道。近年来发现肠道菌群的变化与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发生有着极为重要的关联性，研究表明，益生菌与胃肠道感染、细菌移位、胆固醇代谢等有着直接联系。地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）BL3是一种革兰氏阳性（G+）、兼性厌氧、孢子形成的益生菌，俗称整肠生，是一种存在多种特殊功能的菌株，能产生多种酶及蛋白等物质，在畜牧业、农业、医药、食品等方面均有极为广泛的研究价值。地衣芽孢杆菌以活菌制剂对疾病发挥着防治作用，且对生物体自身无任何伤害。因此可利用其对人体无害，甚至还促进人体中外来细菌或过盛细菌的拮抗作用，通过细菌对细菌的抑制作用和生物拮抗作用达到预防和控制的目的并提高健康水平。因为地衣芽孢杆菌是一种兼性厌氧菌，可以发挥生物夺氧的作用，使益生菌得到更好的生长环境，维持肠道中的生态平衡。目前的研究已经表明哺乳动物Sirtuin蛋白家族可以调节细胞代谢，包括细胞呼吸、脂肪酸代谢等。Sirtuins正常活性的维持有助于延缓，甚至阻止代谢相关疾病的发生。以往对于哺乳动物Sirtuin蛋白家族的研究，表明其广泛参与糖脂代谢的调控及维持能量代谢平衡，并且有望成为代谢疾病的靶点。但就目前的研究来说，有关益生菌Sir2同源蛋白生物学功能却少有报道，益生菌Sir2样蛋白的活性机制尚不明确。且研究发现的以代谢紊乱等为诱发原因的NAFLD，到目前为止仍无特效药物与治疗策略。因此，有必要作进一步研究。
技术实现思路
本专利技术筛选出具有去乙酰化酶活性且依赖于NAD+的地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)BL3Sir2样蛋白并研究其活性强弱，使其在疾病治疗中发挥作用。本专利技术具有去乙酰化酶活性且依赖于NAD+的Sir2样蛋白的地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)BL3，提供了一种来源于地衣芽孢杆菌BL3的具有去乙酰化酶活性且依赖于NAD+的Sir2样蛋白的制备和作用机制，主要是Bli-sir2基因的重组和Bli-Sir2样蛋白的制备、分离、纯化、去乙酰化酶活性鉴定方法。本专利技术还提供了一种去乙酰化酶活性且依赖于NAD+的Sir2样蛋白的制备方法，其特征在于，重组质粒pET-28a(+)-Bli-sir2的构建及其应用，其构建图谱如图1所示。本专利技术还提供了一种去乙酰化酶活性且依赖于NAD+的Sir2样蛋白的制备方法，包括包涵体的制备及其应用。本专利技术还提供了一种包含去乙酰化酶活性且依赖于NAD+的Sir2样蛋白的食品，其特征在于，包括有效剂量的作为活性成分的权利要求1所述具有去乙酰化酶活性且依赖于NAD+的Sir2样蛋白的地衣芽孢杆菌Baclicuslincheniformis和/或其菌体蛋白成分，且可用于静脉注射。本专利技术还提供了一种包含去乙酰化酶活性且依赖于NAD+的Sir2样蛋白的药物，其特征在于，包括有效剂量的作为活性成分的权利要求1所述具有去乙酰化酶活性且依赖于NAD+的Sir2样蛋白的地衣芽孢杆菌Baclicuslincheniformis和/或其菌体蛋白成分，且可用于静脉注射。附图说明图1为实施例1pET-28a(+)-Bli-sir2真核表达载体的构建图谱。图2为实施例1目的蛋白表达鉴定结果，其中M为marker，1为经IPTG诱导，2为未经IPTG诱导。图3为实施例1SDS-PAGE分析BaclicuslincheniformisSir2(Bli-Sir2)蛋白的纯化结果，其中M为marker，1为全蛋白离心上清液，2为洗涤缓冲液A洗脱液，3为洗涤缓冲液B洗脱液，4为结合缓冲液洗脱液。图4为实施例1BCA法对纯化的蛋白进行浓度测定的蛋白标准曲线。图5为实施例1BaclicuslincheniformisSir2(Bli-Sir2)蛋白去乙酰化活性的荧光强度的测定结果，其中ControlA为Bli-Sir2(-)+NAD+(+)，ControlB为Bli-Sir2(+)+NAD+(-)，Bli-Sir2为Bli-Sir2(+)+NAD+(+)，图中数值为均值±标准误；与ControlB组相比，***p<0.001。图6为实施例1构建的pEGFP-N1-Bli-sir2真核表达载体质粒图谱。图7为实施例1pEGFP-N1-Bli-sir2双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定结果图。图8为实施例1免疫印迹法检测重组质粒Bli-Sir2蛋白表达图，其中1为未转染组；2为pEGFP-N1空质粒转染组；3为pEGFP-N1-Bli-sir2重组质粒转染组。图9为实施例1不同肝细胞油红O染色图像（放大倍数为200倍），其中Control为正常大鼠肝细胞对照组；Model为NAFLD大鼠肝细胞的模型组；Vector为NAFLD大鼠肝细胞转染pEGFP-N1的空质粒组；Bli-Sir2为NAFLD大鼠肝细胞转染pEGFP-N1-Bli-sir2的重组质粒组。图10为实施例1Bli-Sir2蛋白影响大鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种来源于地衣芽孢杆菌（

【技术特征摘要】
1.一种来源于地衣芽孢杆菌（Baclicuslincheniformis）BL3的具有去乙酰化酶活性且依赖于NAD+的Sir2样蛋白的制备和作用机制。


2.权利要求1所述的一种来源于地衣芽孢杆菌BL3的具有去乙酰化酶活性且依赖于NAD+的Sir2样蛋白的制备和作用机制，其特征在于Bli-sir2基因的重组和Bli-Sir2样蛋白的制备、分离、纯化、去乙酰化酶活性鉴定。


3.权利要求2所述的Bli-sir2基因的重组和Bli-Sir2样蛋白的制备、分离、纯化、去乙酰化酶活性鉴定，其特征在于，SDS-PAGE分析呈现清晰条带，且灰度分析知蛋白纯度为95.7%以上，浓度为3.1mg/mL以上，测序结果同理论值。


4.权利要求1所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晗笑，徐臻睿，利时雨，
申请(专利权)人：广州溯原生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44